Glioma büyümesi ve ilaç direncinde kromatin düzenleyicilerin araştırılması

Glioblastoma (GBM), düşük sağkalım oranları ile ilişkilendirilen son derece agresif bir primer beyin tümörüdür. Standart terapi yöntemleri cerrahi, radyoterapi ve DNA alkillendirici ajan olarak Temozolomide (TMZ) kemoterapisini içerir. TMZ'nin etkinliği, MGMT gen ekspresyonunun düzenlenmesi gibi çeşitli epigenetik mekanizmalar tarafından olumsuz etkilenebilir ve MGMT'nin promotör metilasyon durumu TMZ yanıtında önemli bir prognostik faktördür. GBM'de sağkalımı ve terapiye direnci düzenleyen yeni epigenetik faktörler henüz keşfedilmemiştir. Bu çalışmada, GBM'deki direnç mekanizmalarını keşfetmek amacıyla TMZ dirençli hücre hatları oluşturduk. Direnç fenotipini in vitro ve in vivo deneylerle gösterdik. Geliştirilen TMZ-dirençli hücre hatlarında transkriptom analizi yaptık ve birçok farklı ifade edilen genler ile birlikte MGMT seviyesinin de önemli ölçüde arttığını gözlemledik. TMZ direncinin epigenetik değişiliklerle ilişkili olabileceğini düşünerek, çeşitli kromatin düzenleyici ve epigenetik enzimlerin hedeflendiği CRISPR/cas9 kütüphanesi EPIKOL ile tarama yaptık. Yapılan taramalar sonucunda, RBBP4 genini TMZ-dirençli hücreler için potansiyel bir hedef olarak belirledik. RBBP4 geninin susturulması sonucu hücre ölümünün arttığı ve hücre bölünmesinin G2/M fazlarında akümüle olduğunu gösterdik. Sonrasında yaptığımız RNA dizileme sonucunda G2/M ve E2F hedef yolaklarının önemli oranda azaldığını tespit ettik. RBBP4 susturulması sonucunda MGMT ekspresyon seviyesinin önemli oranda düşmediğini göstererek, MGMT'den bağımsız bir yolla dirençli hücrelerde hassasiyet oluşturma potansiyelini ortaya koyduk. Transkriptom analizi, MGMT'nin TMZ dirençli modellerde artan bir gen olarak ortaya çıkmasını ve birçok farklı ifade edilen geni içeriyordu. Direncin adaptif epigenetik değişikliklerle ilişkili olabileceğini düşünerek, TMZ dirençli hücrelerde kromatin düzenleyicilerinin rollerini araştırdık. Çeşitli kromatin düzenleyicilerini ve epigenetik enzimleri hedefleyen Epigenetik Knock-Out sgRNA Kütüphanemiz (EPIKOL) ile odaklı bir CRISPR/Cas9 tabanlı tarama yaptık. TMZ dirençli hücre hatlarının seçici hassasiyetini keşfettik ve Retinoblastoma Binding Protein 4 (RBBP4) genini kazanılmış TMZ direncinin bir düzenleyicisi olarak belirledik. Dirençli modellerde RBBP4'in knock-out'u, artan apoptoz ve G2/M tutuklanmasına neden oldu. RNA sekanslama analizi, G2/M kontrol noktası ve E2F hedeflerinin düşük olduğu yolları ortaya koydu. RBBP4 knock-out sonrası MGMT ekspresyonunun önemli ölçüde değişmediğini göstererek, RBBP4'un TMZ-dirençli hücrelerde MGMT'den bağımsız bir düzenleme gerçekleştirdiğine dair kanıt sunduk. Elde ettiğimiz bulgular, gelecekte GBM'yi hedefleyen yenilikçi epigenetik tabanlı tedavi stratejilerinin gelişimi için umut verici bir potansiyel taşımaktadır.