Hemofili A gen tedavisi için transgenik kök hücre platformunun geliştirilmesi ve in vitro etkinliği

Hemofili hastalarının yaklaşık %80' ini etkileyen Hemofili A, Faktör VIII (FVIII) eksikliği sonucu gelişen X' e bağlı resesif kalıtımsal bir kanama bozukluğudur. Hastalar eklem içi ve kas içi kanamalarla ile karakterize olurken, faktör eksikliğinin derecesi, kanama sıklığını ve şiddetini belirlemektedir. Kanamanın kontrolü ve tedavisinde plazma türevli tedaviler ve rekombinant faktör konsantreleri kullanılmaktadır. Araştırmamızda Hemofili A hastalığından sorumlu olan FVIII eksikliğine yönelik gen tedavisi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda promotörü EF-1 alpha olan, B domaini silinmiş FVIII gen sekansı ile CD45 R0 truncated yüzey belirteci taşıyan (EF1α - FVIII.CC - CD45R0t) lentiviral vektör dizayn edilmiştir. Tasarladığımız lentiviral vektörün mezenkimal kök hücreleri transdükte etmesi sağlanarak immün cevaptan korunabilen, sahip olduğu yüzey belirteci (CD45R0t) sayesinde in vivo uygulamalarda takip edilebilen, toksik olmayan ve fonksiyonel FVIII sekresyonu sağlayabilen bir gen tedavisi hedeflenmiştir. Faktör VIII kodlayan lentivirüsün karakterizasyon ve kalite kontrol testlerinin ardından mezenkimal kök hücreler ile transdüksiyon verimliliği, FVIII kalıcılık ve ekspresyon analizleri gerçekleştirilmiştir. Faktör VIII proteinin varlığı Western Blot yöntemiyle de doğrulanmıştır. Geliştirilen lentivirüsün (LTR sekansı) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizleri ile replikatif olmadığı, güvenliliği test edilmiştir. FVIII sekresyonunun zamana bağlı değişimi Elisa yöntemi kullanılarak değerlendirilmiştir. Faktör VIII proteinin fonksiyonelitesi ise karıştırma testi (mixing test) ile aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) ve FVIII düzeyleri üzerinden gösterilmiştir. Zamana bağlı gerçekleştirilen FVIII sekresyon analizlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olmadığı, stabil seviyelerde FVIII varlığı saptanmıştır (p > 0.05). Karıştırma testi (mixing test) kullanılarak gerçekleştirilen analizlerde ise gen tedavisi uygulanmış ve gen tedavisi uygulanmamış FVIII içermeyen insan plazma ürünleri aPTT ve FVIII seviyesi açısından karşılaştırılmıştır. aPTT seviyeleri değerlendirildiğinde; gen tedavisi uygulanmamış gruba ait ortalamanın 92.69 ± 11.38 sn olduğu ancak gen tedavisi uygulanan grupta ise bu ortalamanın 38.60 ± 13.38 sn' ye düştüğü görülmüştür (p < 0.001). Faktör VIII seviyeleri değerlendirildiğinde ise gen tedavisi uygulanmamış grubun FVIII seviye ortalamasının 0.41 ± 0.03 IU/dL olduğu, gen tedavisi uygulanmış grubun ise FVIII seviye ortalamasının %25.41 ± 33.38 IU/dL' ye yükseldiği saptanmıştır (p < 0.01). Bu araştırma ile literatürdeki çalışmalara alternatif olarak Hemofili A gen tedavisinde yeni bir yöntemin geliştirilmesi sağlanmış, in vivo hayvan modelleri ve klinik denemelere katkı sağlayacak bir çalışmanın ilk adımları atılmıştır.