Hidrofobik protein DewA'nın Pichia pastoris ile rekombinant üretimi ve biyoteknolojik uygulamaları

Hidrofobinler, adeze olarak yüzey karakteristiğini değiştirebilme özelliklerinden dolayı birçok biyoteknolojik uygulamada büyük potansiyele sahiptir. Son yıllarda, hidrofobinlerin biyoteknolojik uygulamalarında belirgin bir artış olmakla birlikte, endüstriyel boyutlarda üretimi verim problemlerinden dolayı hala başarılmış değildir. Bu nedenle hidrofobinlerin rekombinant üretimi üzerine daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. Bu tez çalışmasında literatürde yüksek temas açısına sahip olduğu belirlenen Aspergillus nidulans'a ait sınıf I hidrofobin DewA proteininin rekombinant olarak üretimi amaçlanmıştır. Bu amaçla ilk olarak, DewA geninin (UNIPROT: 52750) salgı sinyal dizisi ve dur kodonu çıkarılmıştır. Daha sonra elde edilen diziyi kesmeyen restriksiyon enzimleri biyoinformatik programı kullanılarak tespit edilmiş ve diziye EcoRI ve XbaI enzim kesim bölgeleri eklenmiştir. Ardından kodon optimizasyonu gerçekleştirilerek, dizi sentezlettirilmiştir. Sonuçta DewA proteini pPICZα-A vektörüne aktarılarak AOX1 promotörü altında Pichia pastoris X-33 suşu kullanılarak rekombinant olarak üretilmiştir. En yüksek verim 96. saatte 77 mg/L olarak %1'lik metanol konsantrasyonunda elde edilmiştir. Elde edilen rekombinant proteinin moleküler ağırlığı yaklaşık 15 kDa olarak bulunmuştur. DewA proteinin cam yüzeye kaplanması sonucunda, yüzeyin karakteristiğini değiştirerek hidrofobik hale getirdiği; teflon yüzeylerde ise yine yüzey karakteristiğini değiştirerek, hidrofilik hale getirdiği kanıtlanmıştır. Ardından bu yüzeylere sıcak SDS ve UV uygulaması yapılarak proteinin yüzey stabilitesi değerlendirilmiştir. Sonuçta yüzeye kaplanmış olan DewA proteininin hem cam hem de teflon yüzeylerde sıcak SDS uygulamasına dirençli olduğu; UV uygulamasında ise, cam yüzeylerde UV maruziyeti ile protein degrede olurken, teflon yüzeylerde yapısını koruduğu anlaşılmıştır. Tez çalışması ile A. nidulans'a ait DewA proteini, pPICZα-A vektörüne klonlanarak, P. pastoris X-33 suşunda AOX promotörü kontrolünde ilk kez rekombinant olarak üretilmiştir.