Farklı esansiyel yağlarının ve nanoliflerinin antifungal etkisinin araştırılması

Mikroorganizmalar gıdaların bozulmasına, değer ve kalite kaybına uğramasına ve tüketicide gıda kaynaklı ciddi hastalıklara sebep olabilmektedir. Bu nedenle gıdaların korunması hem ekonomik hem de sağlık açısından ciddi önem taşımaktadır. Günümüzde gıdaların korunmasına yönelik farklı fiziksel ve kimyasal birçok metot vardır. Hepsinin prensibi farklı olmasına karşın, ana amaçları gıdanın korunmasına yöneliktir. Ancak toplumda sentetik, kimyasal ve doğal olmayan gıda koruma yöntemlerine karşı oluşan ön yargı, teknolojiyi daha doğala yönlendirmiştir. Bu nedenle son zamanlarda, gıda ürünlerinde doğal antimikrobiyal ve koruyucu kullanımına karşı yönelim ciddi bir önem kazanmıştır. Farklı kaynaklardan elde edilebilen çok fazla çeşitte doğal antimikrobiyaller mevcuttur. Bu maddeler küf, bakteri, alg, bitki ve hayvan kaynaklı olabilmektedir. Bitkisel kaynaklı antimikrobiyal özellik gösterdiği belirtilen esansiyel yağlara olan ilgi artmakta ve her geçen gün farklı bilimsel çalışmalar yayınlanmaktadır. Doğal, antimikrobiyal ve bitkinin sıvı ikincil metaboliti olan esansiyel yağlar, sentetiklere ve gıda kaynakları hastalıkların sonucu olan sağlık problemlerine karşı artan farkındalık ile toksik etki göstermiyor oluşu gıdaların korunmasında kullanılmaları için önem kazanmasını ciddi oranda etkilemektedir. Esansiyel yağlar fenolik, organik asit, aldehit, terpenoid gibi yapılarda bulunan yaklaşık olarak altmış farklı bileşenden oluşmaktadır. Sadece başlıca bileşenler değil, aynı zamanda daha az bulunan bileşenler de antimikrobiyal aktivitede kritik rol oynamaktadır. Bu esansiyel yağlar çeşitli ekstraksiyon metotları ile elde edilmektedir. Ancak ekstraksiyon metodu, bitkinin ekstraksiyon yapılan organı, mevsim, toprak özellikleri iklim, oksijen ve bitkinin yaşı esansiyel yağların yapısında yer alan bileşenlerin oranlarını değiştirir. Bu da esansiyel yağların antimikrobiyal aktivitesini doğrudan etkilemektedir. Esansiyel yağlar antimikrobiyal özelliği ile mikrobiyal gelişmeyi farklı metotlar ile engelleyebilmektedir. Esansiyel yağların içeriğinde yer alan bileşenler, hücre zarının bozulması, geçirgenliği etkileyerek hücre içi dengenin değişmesi ve enzim fonksiyonlarının bozulmasını içeren farklı mekanizmalar ile mikrobiyal hücreleri etkiler. Bu sonuçların en temel sebebi hidrofobik karakterlerinden dolayıdır. Diğer bir yandan, esansiyel yağların kararlılığı sıcaklık ve ışık gibi çevresel stresler altında son derece düşüktür. Bu nedenle antimikrobiyal özelliklerini korumak için bazı metotlara ihtiyaç duymaktadır. Günümüzde ise gelişen teknoloji ile kapsülleme, kaplama ve yenilebilir film üretilmesi gibi çalışmalar denenmektedir. Bu çalışmada, küf suşları son kullanma tarihi yaklaşmış paketli ekmek ürünlerinden (organik, tam buğday ve tost ekmeği) izole edilmiştir. Moleküler tanımlama sonrası, P. carneum, A. flavus and A. niger takip eden deneylerin yapılması için seçilmiştir. Kimyasal içeriği analiz edilen zencefil, kimyon, tarçın, karabiber, mercanköşk ve karanfilin ve bunların uçucu bileşenlerinin antifungal etkisi sırasıyla disk difüzyon ve disk volatilizasyon metotları ile incelenmiştir. Petri kapları 25ºC'de 6 gün inkübe edilmiş ve 3 ve 6 gün sonra inhibisyon çapları ölçülmüştür. Analiz edilen esansiyel yağların içinde, zencefil ve karabiber test edilen küf suşlarına karşı az ya da hiç etki göstermezken, mercanköşk 6 günlük inkübasyon boyunca test edilen küf suşlarına karşı en çok etkili esansiyel yağ olarak belirlenmiştir. Üç günün sonunda ikinci en çok etki eden esansiyel yağ kimyon olmuştur ancak etkisini takip eden diğer 3 günün sonunda koruyamamıştır. Bu çalışmanın ikinci kısmında, küf suşlarına karşı etkili bulunan ilk 4 esansiyel yağ (kimyon, tarçın, mercanköşk ve karanfil) minimum inhibisyon konsantrasyonu (MIK) ve minimum fungisidal konsantrasyon (MFK) değerlerinin belirlenmesi için seçilmiş ve kullanılacak esansiyel yağ konsantrasyonları 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000 and 5000 µg/mL olarak belirlenmiştir. 14 günlük inkübasyon sonunda mercanköşk ve kimyonun, tarçın ve karanfile kıyasla daha az etkili olduğu, elde edilen daha yüksek MİK değeri ile anlaşılmıştır. Buna paralel şekilde MFK değerleri de daha yüksek bulunmuştur. Seçilen konsantrasyonlar arasında 500 ve 750 µg/mL tamamen yok etme özelliği göstermezken, en düşük MİK konsantrasyonu 1000 µg/mL olmuştur. En yüksek MİK değeri ise 3000 µg/mL ile kimyonda gözlemlenmiştir. Yağların bazıları bazı küf suşlarında aynı MİK ve MFK değerlerini vermiştir. Ardından 14 günlük inkübasyon sürecinde ölçülen küf gelişim çapları ile yağların küf gelişimini engelleme özelliği incelenmiştir. MİK ve MFK değerlerinden de anlaşıldığı üzere tarçın ve karanfil çok daha yüksek bir yüzde de engellemeyi gerçekleştirmiştir. Tarçının incelenen tüm küfleri engelleme yüzdesi % 57 – 100 arasında değişirken, karanfil % 67 – 100 arası değişiklik göstermiştir. Kimyon ve mercanköşkün ise hesaplanan yüzdeleri sırasıyla % 8 – 100 ve % 15 – 100 olmuştur. 1500 µg/mL konsantrasyonundan itibaren ise tüm küf suşları % 100 engellenmiştir. Gün gün ölçümü yapılan gelişme çapı ile ise küflerin farklı yağlarla konsantrasyonlara göre gelişim hızı grafiklerle gösterilmiştir. Beklendiği üzere tüm küf suşlarında kontrol grubu en hızlı gelişmeyi göstermiştir. Birçok grafikte görüldüğü üzere, küf gelişimi 500 µg/mL konsantrasyonu için 2 ile 4. günler arasında başlamıştır ve kimyon ile mercanköşk esansiyel yağlarında kontrol grubuyla yaklaşık aynı hızda gelişme göstermiştir. Ancak tarçın ve karanfil, küf gelişimi gözlemlenmesine rağmen 14 günlük inkübasyon sonunda kontrol grubu ile aynı gelişim çapına ulaşamamıştır. Tüm bu yapılan çalışmaların ardından, karanfil ve tarçın esansiyel yağı, nanolif filminin üretilmesi için seçildi. Elektro çekim çözeltisi, polivinil alkol (PVA) (6 %, 3 saat karıştırma, 80ºC, 700 rpm), β-siklodekstrin (2 %, 1 saat karıştırmaya devam, 55ºC, 700 rpm) ve esansiyel yağ (2%, 2.5 saat karıştırmaya devam, 55ºC, 700 rpm) karışımı olarak hazırlanmıştır. Elektro çekim çözeltisinin viskosite, yüzey gerilimi ve elektriksel iletkenlik analizleri yapılmıştır. Bu analizler sonucunda esansiyel yağların değerlerde artışa sebep olduğu gözlemlenmiştir. Ardından nanolif filmler 20 gauge demir iğne, 12 cm uzaklık, 0.4 mL/s akış hızı, 14-16 kV aralığında voltaj ile yürütülen prosedür ile üretilmiştir. Üretilen nanoliflerin karakterizasyonu başarılı bir nanolif üretiminin yapılıp yapılmadığını gösterdiğinden büyük bir önem taşımaktadır. Bu nedenle çözelti hazırlarken kullanılan ham maddeler ile üretilen nanolif filmlerin karakterizasyonu Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ile yapılmıştır. Ardından elde edilen grafikler birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Bir sonraki aşama için kontrol grubu olarak esansiyel yağ içermeyen sadece PVA'dan oluşan PVA nanolif filmi üretilmiş ve PVA hammaddesi ile kıyaslanmıştır. Kıyaslama sonucunda ciddi bir benzerlik gözlemlenmiştir. Ardından PVA, β-siklodekstrin, esansiyel yağ ve esansiyel yağ nanolif filmi karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmalar sonucunda başarılı bir şekilde nanolifin eklenen hammaddeleri içeriğine aldığı ve esansiyel yağın nanolif içerisinde kaybolan bazı değerlerinin de β-siklodekstrin ile başarılı bir enkapsülasyon işlemi gerçekleştirdiğini göstermiştir. Nanolif film üretiminin ardından, onların antifungal etkilerinin ölçülmesi çalışılmıştır. Nanolif filmleri küf solüsyonun eklenmiş ve 25°C'de 1 günlük bekleme sonrası ekim yapılmıştır. 2 günlük inkübasyon sonunda gelişen koloni sayılarına göre tarçının azaltıcı etki gösterdiği ancak karanfilin etkisiz olduğu sonucu bulunmuştur. Sayısal azalma dışında aynı zamanda büyüyen kolonilerin büyüklükleri de karanfil ve PVA nanolif filmi ile farklılık göstermiştir. Çalışmanın son aşamasında ise üretilen nanolif filmler ile küflerin izole edildiği ekmek tiplerinden biriyle paketleme işlemi yapılmıştır. Kontrol grubu olarak nanolif ile paketlenmeyen organik ekmek 3. günden sonra küflenmeye başlamıştır. Ancak tarçın ve karanfil nanolif filmi ile paketlenmiş olan ekmeklerde herhangi bir küf gelişimi gözlemlenmemiştir.