Mikroakışkan sistemler kullanılarak mekanik kuvvetlerin endotel ve monosit hücre davranışı üzerine etkilerinin incelenmesi

İnsan fizyolojisinde, hücrelerin sadece biyokimyasal işaretleri değil aynı zamanda hücre ve doku işlevselliği üzerinde önemli rol oynayan mekanik kuvvetler, geometri ve matriks esnekliği gibi fiziksel faktörleri de algılayabildiği de bilinmektedir. Mekanobiyoloji, mekanotransdüksiyon süreciyle bu fiziksel faktörlerin temel olarak görev yaptığı çalışma alanıdır. Mekanotransdüksiyon, mekanik kuvvetleri ve bu kuvvetlerin elektriksel ve biyokimyasal sinyallere dönüştürülmesini algılamak için gerekli olan fizyolojik bir süreçtir. Mekanotransdüksiyon sürecinde önemli rol oynayan hücre membranı, hücre ile dış ortam ya da komşu hücreler arasında arayüz oluşturur ve meydana gelen genel doku deformasyonu sebebiyle hücreler mekanik stresi membran aracılığıyla çoğunlukla gerilme ya da sıkışma şeklinde algılar. Sıkışma, gerilme ve kan akışı ile oluşan kayma gerilmesi vücutta hücre üzerine etki eden mekanik uyaranlardan en önemlileridir. Bu mekanik uyaranlar, farklı elektrofizyolojik ve biyokimyasal cevapları tetikleyerek doku dengesinin devamlılığını sağlayabilmek için gerekli olan gen ifadesi, protein sentezi, hücre büyümesi, farklılaşması ve ölümü gibi hücresel işlevlerinin düzenlenmesinde temel rol oynamaktadır. Hücre düzeyinde, hücre dışı ortamı algılama ve bu ortama verilen yanıttan oluşan çekim kuvvetleri yara iyileşmesi, anjiyogenez ve metastaz gibi birçok biyolojik süreci etkileyebilmektedir. Bu nedenle bu mekanik kuvvetlerin büyüklük ve doğrultu açısından karakterizasyonu, doku ve organ düzeyinde fizyolojik ve patolojik olayları tahmin etme ve anlamada faydalı olabilir. Doku ve organ düzeyinde, fizyolojik olayların sürdürülmesinde büyük oranda etkisi olan ve kanda birim alana düşen sürtünme kuvveti olarak tanımlanan kayma gerilmesi, damarların iç yüzünü döşeyen endotel hücrelerinin üzerinde gelişim ve fizyoloji açısından çok büyük öneme sahiptir. Bu kayma gerilmesi, bir borunun çapraz kesitinde meydana gelen akış hızı değişimiyle ilişkilidir. Hız merkezde en fazlayken duvara yakın yerde sıfırdır. Merkezden damar duvarına bir dik indirildiğinde, en yüksek kayma gerilmesi kuvvetinin damar duvarı üzerine etki ettiği görülmektedir. Kayma gerilmesine verilen biyolojik cevapların vasküler hastalıkları önlemede önemli rol oynadığı görülmektedir. Toplardamar sisteminde, akışın atımlı olmayan karakterinden kaynaklanan değişiklikler nedeniyle kayma gerilmesi düşüktür ve 0.076-0.76 Pa arasındadır. Arterlerde ise yüksek kayma gerilmesi nedeniyle akış laminar ve atımlıdır ve kayma gerilmesi, geniş arterler için 1-7 Pa, daha küçük olan arterioller için ise 2-6 Pa arasındadır. Vasküler hücre biyolojisini laboratuvarda çalışmak, in vivo ortamdaki dinamikleri ve 3 boyutlu yapıyı taklit etmek açısından zordur. In vitro yapılan çalışmalar, paralel plakalar şeklinde hazırlanmış akış haznelerinde damar yapısının iç kısmını oluşturan endotel hücrelerini kayma gerilmesine maruz bırakarak gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bunun gibi büyük sistemlerin yerine kullanılabilen ve mikroakışkan teknoloji ile üretilen cihazlar sayesinde kayma gerilmesi başta olmak üzere birçok mekanik kuvvetin etkisi in vitro ortamda araştırılabilmektedir. Mikroakışkan teknoloji kapsamında tasarlanan ve üretilen bu mikroakışkan cihazlar metal, cam ya da polimer malzemeden üretilebilmektedir. Örneğin; genelde hücre biyolojisi çalışmalarında kullanılan mikroakışkan cihazların üretiminde ucuz, biyouyumlu ve saydam olması nedeniyle polidimetilsiloksan kullanılmaktadır. Polidimetilsiloksan malzemeden üretilen mikroakışkan cihazların hücre kültürü uygulamaları ve testlerinde kullanılan geleneksel yöntemlere göre az miktarda örnek ya da madde kullanımı, sabit sıvı akışı ile hücre kültürü ortamının sağlanması gibi üstünlükleri vardır. Aynı zamanda saydam malzemelerden üretilen mikroakışkan cihazların floresans mikroskop ya da spektroskopi incelemelerine uygunluğu hücre davranışının takip edildiği uzun süreli ve yüksek büyütmeli çalışmaların gerçekleştirilmesine imkan vermektedir. Bu tez projesi kapsamında, mikroakışkan kanallar öncelikle, aterosklerotik damar yapısına özgü olacak şekilde dar geçiş bölgelerinde değişen basınç ve kayma gerilmeleri göz önüne alınarak kaviteli yapıda tasarlanıp MEMS teknolojisi ile üretilmiştir. Tasarımı ve simülasyon çalışmaları yapılan düz ve kaviteli mikrokanallara damar duvarının iç yüzeyini döşeyen endotel hücre soyu olan HUVEC hücreleri ekili kaviteli ve düz mikrokanallara şırınga pompa ile medyum akışı verilerek 0.25 ve 0.75 Pa kayma gerilmesi 4 saat boyunca uygulanmıştır (her grup ve kayma gerilmesi için farklı zamanlarda ve ayrı ayrı). Ayrıca TNF-'nın F-aktin ve ICAM-1 sentezini arttırdığı bilindiği için deney grupları TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen olacak şekilde iki alt gruba ayrılmıştır. Phalloidin işaretli HUVEC hücrelerinde F-aktin sentezindeki artış multifoton mikroskobu altında incelenmiştir. Floresan ışık yoğunluğu Image J 1.50i programı ile analiz edilmiştir. Sonuçlara göre, TNF- ile muamele edilmeyen grupta, düz ve kaviteli mikrokanallar arasında anlamlı bir fark saptanmamakla beraber kayma gerilmesinin artmasıyla F-aktin sentezinin azaldığı görülmüştür. TNF- ile muamele edilen grupta ise, TNF-'nın F-aktin sentezini muamele edilmeyen gruba göre arttırdığı gözlemlenmiştir. Kayma gerilmesine maruz kalan HUVEC'lerde ICAM-1 gen ekspresyonunda meydana gelen değişiklikler ise qRT-PCR ile incelenmiştir. Sonuçlara göre, TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen düz ve kaviteli kanallarda 0.25 Pa kayma gerilmesine maruz kalan hücrelerde ICAM-1 mRNA seviyesi 0.75 Pa grubuna göre daha azdır. Ateroslerotik plak bölgelerinde inflamasyon varlığı nedeniyle monositlerinde sürece olan katkısından dolayı F-aktin protein sentezi ve ICAM-1 mRNA seviyelerine endotel hücrelerinde incelendiği gibi monosit hücrelerinde de incelenmiştir. Bu doğrultuda, THP-1 hücreleri 4, 15 ve 45 Pa kayma gerilmesine ayrı ayrı 0.5 ve 3 saat boyunca maruz bırakılmıştır. Ayrıca TNF-'nın F-aktin ve ICAM-1 sentezini arttırdığı bilindiği için deney grupları TNF- ile muamele edilen ve edilmeyen olacak şekilde iki alt gruba ayrılmıştır. Falloidin işaretli THP-1 hücrelerinde F-aktin protein sentezi floresan mikroskop ile incelenerek floresan ışık yoğunluğu Image J 1.50i program ile analiz edilmiştir. Ortalama ışık yoğunluğuna göre, F-aktin protein sentezi 0.5 saat sonra 4 ve 45 Pa kayma gerilmelerinde belirgin olarak tespit edilmesiyle beraber en büyük artış 15 Pa'da gözlemlenmiştir. Maruz kalma süresi arttıkça da 45 Pa'da F-aktin polimerizasyonunda azalma gözlemlenmiştir. F-aktin protein sentezindeki artış en çok 15 Pa kayma gerilmesinde görüldüğünden THP-1 hücrelerinde ICAM-1 mRNA seviyesinin belirlenmesi sadece 15 Pa'da qRT-PCR ile incelenmiştir. Sonuçlara göre, kontrol grubuna göre deney grubunda yaklaşık iki kat artış gözlemlenmiştir. Aterosklerotik bölgelerde monosit ve endotel hücrelerinden lökosit çağrımı için salgılanan IL-8 kemoçekim molekülünün kayma gerilmesine maruz kalan THP-1 hücrelerinden salgılanma seviyesi incelenmiştir. Bu nedenle THP-1 hücreleri 4, 15 ve 45 Pa kayma gerilmesine 3 saat boyunca maruz bırakılarak IL-8 seviyesi ELISA ile incelenmiştir. Floresan ışık yoğunluğu sonuçlarına göre, kontrol grubuna göre deney gruplarında azalma gözlemlenmiştir. Kontrol grubu dışında, en yüksek seviye 15 Pa'da en düşük seviye ise 45 Pa'da gözlemlenmiştir. Kayma gerilmesinin endotel ve monosit hücreleri arasındaki tutunmayı nasıl etkilediğini araştırmak için ayrı ayrı 0.5 ve 3 saat boyunca 15 Pa kayma gerilmesine maruz kalan Hoescht 33342 floresan işaretli THP-1 hücreleri kuyucuklara ekilen HUVEC hücreleri üzerine eklenerek 1 saat inkübasyondan sonra yıkanıp HUVEC hücrelerine tutunan hücrelerin floresan mikroskopta görntüleri alınmıştır. Tutunan hücre sayıları Image J 1.50i program ile sayılmıştır. Sonuçlara göre, kayma gerilmesine maruz kalma süresi arttıkça tutunma seviyesinin azaldığı gözlemlenmiştir. Gerçekleştirilen bu incelemelerden elde edilen veriler, ateroskleroz tedavisinde hedef alınan moleküler mekanizmanın belirgin bir şekilde ortaya konmasını sağlayarak bilimsel ortamlarda yapılacak yayınlar ile ileride yapılacak olan tanı, tedavi ve yeni ilaç tasarımlarına imkan sağlayacaktır. Ayrıca kayma gerilmesine maruz kalan hücrelerde ilgili moleküllerde meydana gelen değişikliklerin mikroakışkan sistemler ile incelenmesi nanoteknoloji alanında yapılacak çalışmalara büyük katkı sağlayacaktır.