Meme kanseri hücre kültürlerinde trabectedin (ET-743) molekülünün etkileştiği moleküler sistemlerin araştırılması

Trabectedin (ET-743), Ecteinascidia turbinata?dan (deniz fıskiyesi) 1969 yılında izole edilen antikanser bir moleküldür. Günümüzde ise sentetik olarak üretilen bu molekül, 2007 yılında yumurtalık kanseri ve yumuşak doku sarkomlarında tek başına veya mevcut kemoterapötiklerle kombine olarak kullanılmaya başlanmıştır. Ancak, Trabectedin?in çeşitli kanser hücre hatlarında hangi yolaklar üzerinden etki gösterdiği büyük ölçüde aydınlatılmayı beklemektedir. Bu çalışmanın amacı, insan normal meme (MCF-10A) ve meme kanseri hücre kültürlerinde (MDA-MB-453 ve MCF-7) Trabectedin?in (1) hücre çoğalmasını engelleyici etkisini, etkileşime girdiği olası (2) apoptotik ve (3) anti-anjiyogenik molekülleri, (4) hücre içi redüksiyon/oksidasyon dengesini düzenleyici molekülleri, (5) epigenetik düzenlemede rol oynayan kritik molekülleri güncel moleküler yöntemlerle belirlemektir. Trabectedin?in hücre canlılığı üzerindeki etkilerinin araştırılmasında XTT canlılık testi ve xCELLigence sistemi kullanıldı. Trabectedin?in antiproliferatif etkisinin apoptozis üzerinden gerçekleşip gerçekleşmediği DNA fragmentleri ve mitokondriyal membran potansiyeli ölçülerek belirlendi. Apoptozisin hangi moleküller üzerinden gerçekleştiğine dair hipotez üretebilmek için ön çalışma olarak apoptozisle ilişkili 35 molekül içeren ?apoptozis antikor array? (çoklu western blot) yöntemi kullanıldı. Apoptozisin ölüm reseptörleri aracılığıyla mı (ekstrinsik yolak) yoksa mitokondri aracılı mı (intrinsik yolak) gerçekleştiğinin belirlenmesi amacıyla sırasıyla Kaspaz-8 ve Kaspaz-9 inhibitörleri kullanılarak DNA fragmentasyon miktarındaki değişimler gözlendi. İlgili apoptotik yolaktaki moleküller Western Blot ve qRT-PCR yöntemleriyle doğrulandı. Trabectedin?in meme kanseri hücrelerinde etkilediği anjiyojenik moleküller, 55 molekül içeren antikor array kullanılarak belirlendi. Trabectedin'in hücre içi oksidasyon/ redüksiyon dengesini etkileyip etkilemediği ise reaktif oksijen türevlerinin ve Glutatyon S Transferaz (GST) enzim aktivitesinin ölçümü ile belirlendi. Trabectedin molekülünün meme kanseri hücrelerindeki epigenetik süreçleri etkileyip etkilemediği ise Histon Deasetilaz (HDAC) ve DNA Metiltransferaz (DNMT) enzim aktivitelerinin ölçümü ile araştırıldı. Trabectedin?in insan meme kanseri hücre kültürleri (MCF-7 ve MDA-MB-453) üzerinde artan doza (10-6 -10-12 M) ve zamana (24., 48. ve 72. saat) bağlı olarak sitotoksik etki gösterdiği belirlendi. Trabectedin?in 48. saatteki IC50 değerleri MCF-7 ve MDA-MB-453 hücre kültürlerinde sırasıyla 4.8±0.8 ve 2.5±0.4 nM olarak hesaplandı. Trabectedin?in insan MCF-10A normal meme epitel hücreleri üzerindeki doza ve zamana bağlı sitotoksik etkisinin meme kanseri hücre kültürlerine oranla daha az olduğu belirlendi (IC50= 9.55x10-9 nM). Trabectedin ile muamele edilen meme kanseri hücre kültürlerinin DNA fragmentasyon miktarında doza ve zamana bağlı; MCF-10A hücrelerinde ise sadece yüksek dozlarda (?10-7 M) artış belirlendi. Trabectedin?in MCF-7 ve MDA-MB-453 hücrelerinin mitokondriyal membran potansiyelinde doza bağlı olarak anlamlı azalışa yol açtığı belirlendi. Trabectedine 48 saat maruz bırakılan MCF-7 hücre kültürlerinde proapoptotik moleküllerden TRAIL R1/DR4 (2.6 kat), TRAIL R1/DR5 (3.1 kat), Fas/TNFRSF6 (1.7 kat), TNF RI/TNFRSF1A (11.2 kat) ve FADD (4.0 kat)?da kontrol hücrelerine göre artış belirlendi (p?0.05). Apoptozis inhibitör proteinleri (AIP) ailesinden olan CIAP-1, XIAP, Livin ve Survivin?de sırasıyla 5.5, 2.5, 2.6, 3.0 kat azalış tespit edildi (p?0.05). MDA-MB-453 hücre kültürlerinde ise 48 saat Trabectedin muamelesi sonucu proapoptotik moleküllerden Bad, Bax, aktif-kaspaz-3, Sitokrom-c, SMAC/DIABLO, Htra2/Omi?de sırasıyla 3.6, 4.2, 4.4, 4.8, 4.5 ve 5.2 kat artış belirlendi (p?0.05). Antiapoptotik moleküllerden Bcl-2, Bcl-XL, Pro-kaspaz-3?de 4.8, 5.2 ve 6.0 kat azalış tespit edildi (p?0.05). AIP ailesinden olan CIAP-1 ve Survivin?de ise sırasıyla 5.0 ve 2.7 kat azalış tespit edildi (p?0.05). Trabectedin muamelesi sonucu MCF-7 hücre kültürlerinde, proapoptotik moleküllerden TRAIL R1/DR4, TRAIL R2/DR5, TNF RI/TNFRSF1A, FADD ve Fosfo-p53 mRNA düzeylerinde sırasıyla 2.9, 2.1, 8.4, 2.1 ve 3.5 kat artış, antiapoptotik moleküllerden CIAP-1 ve XIAP mRNA düzeylerinde ise sırasıyla 4.2 ve 3.8 kat azalış belirlendi (p?0.05). MDA-MB-453 hücrelerinde proapoptotik moleküllerden Bax, Bad, Sitokrom c ve SMAC/Diablo mRNA düzeylerinde sırasıyla 2.6, 2.5, 3.4, 10.5 kat artış, antiapoptotik moleküllerden Bcl-2 mRNA?sında ise 1.8 kat azalış, belirlendi (p?0.05). Kaspaz-8 ve Kaspaz-9 spesifik inhibitörleri kullanılarak, Trabectedin?in apoptozisi MCF-7 hücrelerinde ölüm reseptörleri aracılı yolak üzerinden, MDA-MB-453 hücrelerinde ise mitokondri aracılı yolak üzerinden indüklediği belirlendi. Trabectedin öncesi Kaspaz-3 inhibitörüyle ön muamele edilen MDA-MB-453 hücre kültürlerinde, DNA fragmentasyonunda yalnızca Trabectedin?le muamele edilen hücrelere göre anlamlı değişim gözlenmedi (p>0.05). Trabectedin muamelesi sonucu MCF-7 hücre kültürlerinde anti-anjiyojenik moleküllerden Serpin E1/PAI-1 ve TIMP-1 proteinlerinde sırasıyla 3.5 ve 4.2 kat artış tespit edildi (p?0.05). Tissue Factor/Factor III, DPPIV/CD26, uPA, VEGF pro-anjiyojenik moleküllerinde ise sırasıyla 8.4, 6.2, 6.2, 6.8 kat azalış tespit edildi (p?0.05). MDA-MB-453 hücrelerinde ise Trabectedin muamelesi sonucu anti-anjiyojenik moleküllerden ENDOGLIN, PF4, TIMP-1 ve TIMP-2?de sırasıyla 26.0, 3.5, 3.0, 2.2 kat artış tespit edilirken (p?0.05), pro-anjiyojenik moleküllerden IGFBP-2, MMP-8, MMP-9 ve VEGF?de sırasıyla 4.2, 6.2, 2.1, 8.4 kat azalış tespit edildi (p?0.05). Trabectedin dozlarına (10-12 -10-6 M) bağlı olarak, meme kanseri hücre kültürlerinde reaktif oksijen türevlerinin oluşumunda anlamlı artış tespit edildi. Kırk sekiz saat süresince Trabectedin uygulanan MCF-7 ve MDA-MB-453 hücrelerinde GST aktivitesinde artış belirlendi (p?0.05). Epigenetik belirteçlerden DNMT ve HDAC aktivitelerinde ise her iki meme kanseri hücre hatlarında anlamlı azalış tespit edildi (p?0.05). Bu tez, Trabectedin?in meme kanseri hücre kültürlerinde sitotoksik, apoptotik ve anti-anjiyojenik etkileri olduğunu gösteren ilk in vitro çalışmadır. Bu veriler, Trabectedin?in in vivo ve faz çalışmaları tamamlandığı taktirde meme kanseri tedavisinde kullanılabilecek etkili bir kemoterapötik molekül olduğunu göstermektedir.