Real-time imaging of nitric oxide (NO) signals derived from differentially targeted endothelial nitric oxide synthases (eNOS) using genetically encoded biosensors

Nitrik oksit (NO), makrofaj, nöron ve endotel hücreleri dahil birçok farklı hücre tiplerinde üretilen gaz halindeki bir moleküldür. Endotelyal hücrelerde NO, düz kas hücrelerinin gevşemesini ve vasküler tonunun düzenlediği bilinen kalsiyum bağımlı endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) tarafından üretilir. Fizyolojik koşullarda, eNOS hücre zarındaki kaveolada lokalizedir genellikle protein-protein etkileşimleri nedeniyle aktif değildir. eNOS'un hücre içi farklı bölmeleri arasındaki translokasyonun NO üretimini etkileyebileceği de gösterilmiştir. Bununla birlikte, literatürdeki ilgili çalışmaların çoğunda, uygun araçların bulunmaması nedeniyle lokal eNOS kaynaklı NO biyoyararlanımı araştırılamamıştır. Bu diploma tezinde NO ve Ca2+ için yeni multispektral görüntüleme tekniklerinden yararlanılarak bu konu gözden geçirilmiştir. Bu amaçla, yüksek mekân-zamansal çözünürlük ve yüksek seçicilik ile canlı hücrelerde NO tespiti sağlayan yeni genetik olarak kodlanmış NO sensörü (geNOps) kullanılmıştır. Lokal Ca2+ sinyallerinin görselleştirilebilmesi için GECO' ların kırmızı ve farklı hedefli varyantları kullanılmıştır. Farklı hücresel lokallerde eNOS aktivitesini incelemek için HEK293 hücreleri model sistem olarak kullanılarak yabani tip (wild type)-eNOS ile nükleer hedefli eNOS karşılaştırılmıştır. Her iki bölmede de eNOS'un aktivasyonu için gerekli olan Ca2+ sinyalleri tespit edilmiştir. Bu yaklaşım, çekirdekteki eNOS aktivitesinin, aynı deney koşulları altında yabani tip-eNOS'a kıyasla önemli ölçüde azaldığını, ancak yine de aktif olduğunu açıkça gösterilmiştir. Bu tezde, farklı hücre içi lokallerdeki eNOS aktivitesi farklılıklarını ortaya çıkarmak amacıyla multispektral görüntüleme tekniklerinden yaralanılmıştır ve lokal Ca2+ ortamının eNOS aktivitesindeki farklılıkları etkilemediği ilk kez, doğrudan kanıtlanmıştır.