Reseptörle etkileşen serin treonin kinaz 4 (RIPK4)'ü sürekli eksprese eden HaCaT hücre hattı oluşturulması

Deride koruyucu bariyer rolünü üstlenen epidermis çok katmanlı bir yapıdır. En alt katmanda bulunan bazal tabakadaki kök hücreler dermisten gelen komutla asimetrik bölünerek bazal tabakadan uzaklaşmaya başlar ve farklılaşarak subrabazal katmanları oluşturur. Epidermal farklılaşma olarak adlandırılan bu süreç çok hassas bir şekilde düzenlenirken süreç esnasında oluşabilecek bazı aksaklıklar konjenital anomalilere neden olabilmektedir. Reseptörle Etkileşen Serin Treonin Kinaz 4 (RIPK4), epidermal farklılaşmayı düzenleyen öncül proteinler arasındadır. Fonksiyonu ile ilişkili olarak patolojik RIPK4 varyasyonları konjenital ektoderm gelişim bozuklukları olan BartsocasPapas, Popliteal Pytergium, AEC-Like ve CHAND sendromları ile ilişkilendirilmiştir. Keratinosit hücre hatlarının kullanıldığı laboratuvar koşullarında epidermal farklılaşma süreci iki ila üç hafta arasındadır. Laboratuvar analizleriyle epidermal farklılaşmanın araştırıldığı çalışmalarda normal insan keratinositlerine (NHK) alternatif olarak büyüme koşulları daha kolay olan ölümsüz HaCaT insan keratinosit hücre hattı kullanılmaktadır. HaCaT hücrelerine çalışılmak istenen geni transfekte etmek oldukça zordur. Ayrıca, transfekte edilen HaCaT hücrelerinde istenilen genin ekspresyonu ancak birkaç gün sağlanabilir. Yaklaşık 14 gün süren epidermal farklılaşmanın araştırıldığı çalışmalarda ise incelenecek genin hücrelerde sürekli ekspresyonunun sağlanması gerekmektedir. Bu tez çalışması ile amaçlanan uzun süreli analizlerde kullanılmak üzere araştırılacak genin sürekli ekspresyonuna olanak veren transgenik HaCaT hücrelerini oluşturmak ve bu hücrelerde RIPK4'ün sürekli ekspresyonunu sağlamaktır. Bu amaç doğrultusunda ilk olarak Flp-InTM Sistemi kullanılarak istenilen genin HaCaT genomuna entegrasyonuna olanak veren FRT kaseti hücrelerin genomuna entegre edildi. FRT kasetinin genomda transkripsiyonel olarak aktif bölgeye tek kopya olarak yerleştiği ve hücrenin yaşamsal fonksiyonlarına etkilemediği doğrulandı. Sonrasında RIPK4 geni HaCaT genomuna yerleşmiş FRT kasetine entegre edilerek RIPK4'ü sürekli eksprese eden HaCaT hücreleri oluşturuldu. Oluşturulan bu hücreler ile epidermal farklılaşma süreci gibi uzun süreli hücresel süreçlerin çalışılacağı deneylerin tasarlanması mümkün olacaktır. Anahtar Sözcükler: Epidermal farklılaşma, Flp-In sistemi, HaCaT, Kalıcı Transfeksiyon, RIPK4.