Spirulina platensis proteinleri: Fonksiyonel ve fizikokimyasal özellikleri, anjiyotensin-I dönüştürücü enzim inhibitor aktivitesi, biyoyararlılığı ve enkapsulasyon çalışmaları

Spirulina platensis, simbiyotik, çok hücreli ve ipliksi yapıda mavi-yeşil mikroalgdir. Esansiyel amino asitler, β-karoten, fikobiliproteinler gibi pigmetler ve eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) gibi çoklu doymamış yağ asitleri gibi bazı yüksek değerli biyoaktif moleküller açısından zengindir. Ayrıca, yüksek protein içeriği ile (kuru bazda %60-70) önemli protein kaynaklarından biridir. Bu doktora tezinin amaçları; (i) yüzey-tepki metodu kullanılarak, yüksek toplam fenolik madde, antioksidan aktivite ve in vitro gastrointestinal sindirimden sonra protein sindirilebilirliğine sahip protein ektraktı elde etmek amacıyla Spirulina platensis'ten ultrases destekli protein ekstraksiyonunun optimizasyonu; (ii) iyileştirilmiş fonksiyonel özelliklere sahip protein konsantratları elde etmek için Spirulina platensis'ten ultrases destekli protein ekstraksiyonunun optimizasyonu ve optimum noktada elde edilen protein konsantratının fonksiyonel gruplarının tanımlanması, termal özelliklerinin belirlenmesi ve mikroyapı karakterizasyonu; (iii) enzimatik hidroliz ile elde edilen Spirulina platensis triptik protein hidrolizatlarının antioksidan aktivite ve anjiyotensin-I dönüştürücü enzim inhibitör aktivitesinde in vitro gastrointestinal sindirim sonrasındaki değişimin değerlendirilmesi; (iv) Spirulina platensis protein konsantratı ve kitosan arasındaki kompleks koaservasyonun üzerine protein-kitosan kütle oranı ve pH'nın etkisinin araştırılmasıdır. Tezin birinci bölümünde (Bölüm 1), bu doktora tezinin araştırma çerçevesi, amaçları ve Spirulina platensis ve ondan elde edilen proteinler/peptitler ve bir enkapsulasyon yöntemi olan koaservasyon hakkında literatür özeti sunulmuştur. Tezin ikinci kısmında (Bölüm 2), öncelikle Spirulina platensis tozunun (SPP), AOAC metotları ile kimyasal kompozisyonu ve kromatografik yöntemler ile yağ asidi ve şeker profili belirlenmiştir. Yüksek ekstraksiyon verimi, toplam fenolik madde miktarı (TPC), antioksidan aktivite (AOA) ve in vitro protein sindirilebilirliği değerleri elde etmek amacıyla tepki-yüzey yanıt metodolojisi (RSM) kullanılarak, ultrases destekli ekstraksiyon (UAE) ile SPP'den protein ekstraksiyonu optimize edilmiştir. Deneyler, üç faktörlü Box-Behnken dizaynı (BBD) ile üç seviye pH (7, 8, 9), sıcaklık (25, 35, 45 °C) ve zaman (60, 90, 120 dakika) değerlerinde gerçekleştirilmiştir. SPP, kuru bazda %65,6±0,12 protein, %14,2±0,62 lipit, %10,7 karbonhidrat ve %9,5±0,02 kül içermektedir. Gaz kromatografisi (GC) analiz sonucuna göre SPP'nin yağ asitleri; %56 palmitik asit, %19,63 linoleik asit, %17,07 linolenik asit, %2,98 oleik asit, %2,78 palmitoleik asit ve %1,49 stearik asittir. SPP'nin ultra performans likit kromatografisi (UPLC) ile belirlenen şeker profili, dört şeker molekülünden oluşmaktadır. SPP'de baskın şeker molekülü, toplam şekerin %56'sını oluşturan ramnoz iken, kalan şeker molekülleri %22 glukoz, %8 galaktoz, %5 mannoz ve %9 bilinmeyen şekerdir. Bütün ekstarksiyon koşullarında elde edilen Spirulina platensis protein konsantratlarının (SPPC) fenolik profili UPLC kullanılarak belirlenmiştir. SPPC'larında bulunan fenolik bileşenler; 3-4-dihidroksibenzoik asit, 4-hidroksibenzoik asit, kafeik asit, kafein, kateşin, klorojenik asit, ellajik asit, epikateşin, etil-3-4-dihidroksibenzoat, ferulik asit, fumarik asit, gallik asit, p-kumarik asit, kuarsetin, rutin, sinapik asit, p-kumarik asit, kuarsetin, rutin, sinapik asit, şirinjik asit, t-sinamik asit, vanilik asit, vanilindir. Kafeik asit, kafein, ferulik asit ve şirinjik asit Spirulina platensis'ta yüksek oranda bulunan fenolik bileşenlerdir. Deney verileri, sonuçları tahminlemek için kullanılan denklemlerin belirlenmesi amacıyla kullanılmıştır. Varyans analizine (ANOVA) göre ekstraksiyon verimi, TPC, kuprik iyon indirgeme antioksidan kapasite (CUPRAC) tayini ve 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) tarafından radikal yakalama deneyi ile AOA ve in vitro protein sindirilebilirliği için belirleme katsayısı (R2) değerleri sırasıyla 0,91; 0,84; 0,70; 0,46 ve 0,72 olarak bulunmuştur. CUPRAC (0,70), DPPH (0,46) ve in vitro protein sindirilebilirliği (0,72) hariç, diğer yüksek R2 değerlerine göre; polinomial modeller değişkenler arasındaki gerçek ilişkiyi temsil etmesi bakımından uygundur. RSM analizi temel alındığında, ekstraksiyon verimi (%28,45), TPC (4,84 mg kafeik asit eşdeğeri/g kuru baz), antioksida aktivite (12,23 mg Trolox eşdeğeri/g kuru baz) ve in vitro protein sindirilebilirliği (%90,09) için optimum ekstraksiyon koşulları (sıcaklık: 45 °C, pH: 8,55 ve zaman: 60 dakika) belirlenmiştir. Bu çalışmada, Spirulina platensis'in in vitro protein sindirilebilirliği ilk kez değerlendirilmiştir ve %90'ın üzerinde olduğu bulunmuştur. Bu sonuç, diğer alg ve bir ticari protein kaynağı olarak soya proteini gibi diğer bitkisel proteinlerin in vitro protein sindirilebilirliği değerinden daha yüksektir. Optimum proses koşullarını belirlemek için, modelin ürettiği optimum koşullarda deney tekrarlanmıştır. Deneysel veriler model tarafından tahminlenen değerlere oldukça yakındır ve modelin validasyonunu sağlamıştır. Tezin üçüncü kısmında (Bölüm 3), Spirulina platensis'ten iyileştirilmiş fonsiyonel özelliklere sahip proteinlerin RSM kullanılarak UAE ile optimizasyonu ve optimum noktada elde edilen protein konsantratının fizikokimyasal ve termal özelliklerinin belirlenmesi ve mikroyapı karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Deneyler, üç faktörlü BBD kullanılarak üç seviye pH (7, 8, 9), sıcaklık (25, 35, 45 °C) ve zaman (60, 90, 120 dakika) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Protein ekstraktlarının su absorpsiyon kapasitesi (WAC), yağ absorpsiyon kapasitesi (OAC), köpürme kapasitesi (FC), köpürme stabilitesi (FS), emülsiyon aktivitesi (EA) ve emülsiyon stabilitesi (ES) araştırılmıştır. Varyans analizine (ANOVA) göre; WAC, OAC, %EA, %ES, %FC ve %FS için R2 değerleri sırasıyla 0,87; 0,95; 0,57; 0,37; 0,49 ve 0,79 olarak bulunmuştur. %EA (0,57), %ES (0,37) ve %FC (0,49) hariç, diğer yüksek R2 değerlerine göre; polinomial modeller değişkenler arasındaki gerçek ilişkiyi temsil etmesi bakımından uygundur. RSM analizi temel alındığında, WAC (4,41 g su/g protein), OAC (10,13 g/g protein), FC (%300), FS (%83,94), EA (%42,99) ve ES (%92,50) için optimum ekstraksiyon koşulları (sıcaklık: 43,87 °C, pH: 7,16 ve zaman: 60 dakika) belirlenmiştir. Deney sonuçlarına göre, Spirulina platensis protein konsantratının fonksiyonel özellikleri diğer alg ve bir ticari protein kaynağı olarak soya fasulyesi gibi bitki türlerinden elde edilen proteinlerin fonksiyonel özelliklerine göre daha iyi bulunmuştur. Optimum proses koşullarını belirlemek amacıyla modelin ürettiği optimum koşullarda deney tekrarlanmıştır. Deneysel veriler model tarafından tahminlenen değerlere oldukça yakındır ve modelin validasyonunu sağlamıştır. Optimum noktada elde edilen SPPC'nin karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. pH 2'den 10'a pH aralıklarında SPPC'nin nitrojen çözünürlüğü ve zeta potansiyeli (ζ-potansiyel) belirlenmiştir. SPPC'nin çözünürlüğünün en düşük olduğu (N×6,25= %11,38 (w/w)) ve net yükün nötre (0,250 ± 0,29 mV) yakın olduğu pH ~3,0 değeri SPPC'nin izoelektrik noktasıdır. Ayrıca, pH 10'da SPPC'nin en yüksek çözünürlüğe (N×6,25= % 59,06 (w/w)) sahip olduğu görülmüştür. pH değerinin 3'ün üzerinde olduğu değerlerde SPPC'nin net yükü negatiftir. SPPC'nin ζ-potansiyel'nin pH'ya bağlılığı, amino (NH2) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel gruplarından oluşan proteinin amfoterik yapısından kaynaklanmaktadır. SPPC'nin önemli fonksiyonel gruplarını belirlemek için kullanılan FT-IR spektra ile amid II (1533 cm-1), amid I (N-H, 1631 cm-1) ve karboksil (C=O, 2920 cm-1) bağları görülmüştür. SPPC'nin DSC termografisine göre; SPPC iki denaturasyon sıcaklığına (159,45 ve 165,72 °C) ve denaturasyon entalpisine (-3983 W/g ve -3702 W/g) sahiptir. Tezin dördüncü kısmında (Bölüm 4), tripsin enzimi ile enzimatik hidroliz sonucu elde edilen Spirulina platensis protein hidrolizatlarının (SPPH) % hidroliz derecesi (DH), toplam fenolik madde (TPC), antioksidan aktivite ve angiotensin-I dönüştürücü enzim (ACE) inhibitör aktivite üzerine hidroliz zamanının (4, 6 ve 8 saat) ve enzim:substrat oranının (1:100, 2:100 ve 3:100) etkisi araştırılmıştır. Ayrıca insan gasrointestinal (GI) sindirim sistemini simule etmesi amacıyla bir in vitro sindirim modeli kullanılarak, hidrolizatların mide ve bağırsak sindirimi sonrasındaki TPC, antioksidan aktivite ve ACE inhibitör aktiviteleri belirlenmiştir. SPPH'lerin başlangıç DH değerleri %18,57 ve %25,03 arasında değişmiştir (p < 0,05). En yüksek DH değeri (%25,03), 3:100 E/S oranında ve 8 saat hidroliz zamanında elde edilen hidrolizlarda elde edilmiştir. Triptik hidrolizatların DH değerleri E/S oranına ve hidroliz zamanına bağlıdır (p < 0,05). Pepsin sindiriminden sonra, örneklerin DH değeri %21,39±0,62-%29,22±1,48 arasında değişmiştir (p < 0,05). Diğer taraftan pankreatik sindirimden sonra örneklerin DH değeri %30,73±3,41-%43,12±0,18 olarak bulunmuştur (p < 0,05). Triptik hidrolizatların toplam fenolik madde miktarı 23,97±2,56-41,11±2,71 mg CAE/g kuru baz olarak bulunmuştur. TPC üzerine enzim/substrat oranı ve hidroliz zamanının etkisi önemli bulunmuştur (p < 0,05). Enzimatik hidroliz sırasında hidroliz zamanı arttıkça, daha fazla fenolik bileşik açığa çıkmıştır. Triptik hidrolizatların kuprik indirgeme antioksidan kapasitesi 6,33±1,54 ve 13,71±0,15 mg TE/g kuru baz olarak belirlenmiştir. Hidrolizatların gastrik ve intestinal proteazlar tarafından sindiriminden sonra antioksidan aktiviteleri genel olarak stabil kalmıştır. Triptik SPPH'ların ACE inhibitör aktivitesi %12,50±1,40 ve %21,79±1,52 arasında değişmiştir. E/S oranı ve hidroliz zamanı ile hem başlangıç örneklerin hem de GI sindirim sonrası örneklerin ACE inihibitör aktivitesinde artma söz konusu olmuştur (p < 0,05). Başlangıç SPPH'ların arasında 3:100 E/S oranı ve 8 saat hidroliz zamanında hazırlanan hidrolizatlar en yüksek ACE inhibitör aktivite göstermiştir (%21,79±1,52). Çalışmanın sonuçlarına göre; SPPH'larının ACE inhibitör aktivitesi üzerine mide sindiriminin etkisi genel olarak önemli bulunmamıştır (p > 0,05) fakat, intestine sindirimden sonra daha güçlü ACE inhibitör aktivite gösteren peptitlerin oluşmasıyla, final GI sindirim örneklerinin ACE inhibitör aktivitesi %24,85±1,01-%33,60±2,40 arasında değişmiştir (p < 0,05). Tezin beşinci kısmında (Bölüm 5), Spirulina plantensis proteini ile kitosan arasındaki kompleks koaservasyon üzerine pH (2,0, 3,0, 4,0 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0) ve protein:kitosan kütle oranının (1:1, 2,5:1, 5:1, 7,5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1) etkisi araştırılmıştır. Ayrıca, optimize edilen koaservatların termal özelliklerinin belirlenmesi ve fonksiyonel gruplarının tanımlanması deneyleri gerçekleştirilmiştir. SPPC'nin kimyasal kompozisyonu; %78,7±0,6 protein, %5,1±0,02 mineral (kül), %9,1 karbonhidrat ve %7,1±0,3 nemden oluşmaktadır. SPPC ve kitosanın zeta potansiyeli ölçüm sonuçlarına göre; asidik pH değerlerinde negatif yüklü SPPC ile pozitif yüklü kitosan arasında güçlü bir bağlanma ve elektriksel etkileşim bulunduğu görülmüştür. pH 6,0'da SPPC-kitosan koaservatlarının zeta potansiyeli diğer pH değerlerine göre sıfıra daha yakındır. Bundan dolayı, SPPC:kitosan kütle oranının optimizasyonu için pH 6,0'da farklı SPPC:kitosan kütle oranlarındaki (1:1, 2,5:1, 5:1, 7,5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 30:1) kompleks koaservasyonlar hazırlanmıştır. 1:1, 2,5:1, 5:1 SPPC:kitosan oranlarında hazırlanan koaservatların net yükü, negatif yüklü proteinlerin pozitif yüklü kitosan moleküllerini tamamem bağlamak için yeterli miktarda olmamasından dolayı pozitifte kalmıştır. Diğer taraftan, 7,5:1 SPPC:kitosan oranında hazırlanan koaservatlarda, stokiyometrik dengenin neredeyse sağlandığı görülmüştür. pH 6,0 ve 7,5:1 protein:kitosan oranında hazırlanan koaservatların %bulanıklık değeri ise diğer kütle oranlarında hazırlanan koaservatlar arasında en yüksek değere (p < 0,05, 100-T% = 79,00±0,19) sahip olmuştur. Daha sonra, 7,5:1 protein:kitosan kütle oranında ve pH 2,5'den 9,5'e farlı pH değerlerinde hazırlanan koservatların ileri pH optimizasyonu deneyi gerçekleştirilmiştir. 7,5:1 protein:kitosan kütle oranında ve pH 5,5'de hazırlanan koaservatların zeta potansiyeli neredeyse sıfırdır (0,79±0,41 mV) ve en yüksek bulanıklık değeri (100-T% = 76,80±0,76 p < 0,05) elde edilmiştir. Ayrıca, kompleks koaservasyonun pH'sı 9,5'den 5,5'e düştükçe koaservasyon verimi %14,56±0,02'dan %77,74±0,32'a yükselmiştir (p < 0,05). SPPC'nin FT-IR spektrumu 1631 cm-1 (amide I, C=O), 1533 cm-1, 1449 cm-1 ( amide II, C-N ve N-H bağları), ve 1228 cm-1'de (amide III, C-C, C-N ve C-O bağları) absorpsiyon bandlarında pikler sergilemiştir. Kitosanın FT-IR spektrumu 3292 cm-1 (amin N-H), 2918 cm-1 (C-H bağı vibrasyon gerilimi), 1649 cm-1 (amide I, C=O), 1565 cm-1 (amide II, C-N), 1375 cm-1 (-OH and -CH'ın birleşik vibrasyonu) ve 1150 cm-1 (C-C, C-N, C-O) absorpsiyon bandlarında pikler sergilemiştir. Koaservatın FT-IR spekturumu incelendiğinde ise SPPC ve kitosanın piklerinin bir kombinasyonu şeklinde pikler verdiği görülmüştür. SPPC:kitosan koaservatları, SPPC'nin karboksil grupları (-COO-) ve kitosanın amin grupları (-NH3+) arasındaki elektrostatik etkileşimi gösteren 1565 cm-1 (-COO-) ve 1374 cm-1 (-NH3+) bantlarında pikler sergilemiştir. SPPC, kitosan ve SPPC:kitosan koaservatlarının DSC termogramlarının sonuçlarına göre ise; kompleks koaservatın denaturasyon sıcaklığı ve denaturasyon entalpisi (Td= 209,5 °C ve ΔHd= -3,414 W/g), SPPC'nin denaturasyon sıcaklığı ve denaturasyon entalpisi değerlerinden (Td= 180,5 °C ve ΔHd= -0,877 W/g) daha yüksektir. Bu sonuçlar, koaservat yapıdaki SPPC'nin serbest SPPC'dan daha termostabil olduğunu göstermektedir. Son olarak tezin altıncı bölümünde (Bölüm 6), önceki bölümlerdeki deney sonuçları temel alınarak sonuç, tarışma ve sonraki araştırmalar için tavsiyeler verilmiştir.