Expression analysis of hla-b gene in sporadic behcet syndrome patients

Behçet Sendromu (BS), mukokutanöz lezyonların, vaskülitin, oral ve genital ülserasyonların birincil semptomları ile karakterize, mutisistemik, romatolojik bir inflamatuar hastalıktır. BS, 20 ila 30 yasşlarında bireylerin hayatlarını şiddetle etkilemektedir. Çoğunlukla Akdeniz ve Ortadoğu'da görülür. Türkiye'de 100.000 nüfus sıklığı 20 ila 420 kişi arasında değişmektedir BS etiyolojisi tam olarak bilinmemekle birlikte, literatür bilgilerinin ışığında genetik ve çevresel fakörlerin hastalığın en önemli sebepleri olduğu düşünülmektedir. Nötrofil fonksiyonlarındaki bozukluklar, lemfositlerdeki değişiklikler ve bazı enfeksiyon ajanlarının da Behçet sendromunda rol oynadığı öne sürülmüştür. BS'nin birden fazla dokuyu ve organı etkileyen patolojisi ise tam olarak anlaşılamamıştır. BS ile HLA-B51 geni arasındaki güçlü ilişki hastalığın etiyolojisinde genetik faktörün önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca Behçet Sendromlu ailelerde artan HLA-B51 sıklığı gibi indikasyonlar ile birlikte enfeksiyonel ajanlar ve henüz tanımlanmamış immünolojik mekanizmalar olduğu da bilinmektedir. Bunların içinde HLA-B geninin bir alt aleli olan HLA-B51 aleli, bugüne kadar Behçet Sendromu ile ilişkilendirilmiş en önemli işaretlerden biridir.HLA-B51 (insan lökosit antijeni) HLA-B geninin bir aleli olan HLA-B51 aleli bugüne kadar BS ile ilişkili olan en önemli belirleyicilerden biridir. BS'nin etyolojisi tamamen bilinmemekle birlikte, HLA-B51 ve BS arasındaki güçlü bağlantı sendromunun etyolojisinde genetiğin önemini vurgulamaktadır. HLA-B'nin görevi, bağışıklık sistemindeki T hücrelerine antijen sunumunu başlatmaktır. BS kompleks bir hastallık olduğu için tek bir gen ile ilişkilendirerek hastalığın anlaşılması mümkün değildir. Bu sebeple genomik ilişkilendirme çalışmalarında IL-1, MICA, STAT4, GIMAP2 / GIMAP4 gibi farklı genlerin de BS ile ilişkili olduğu bulunmuştur.Bu çalışmanın en temelinde, epigenetik mekanizmaların etkilerini BS'de anlamak için grubumuzda tüm genomu içeren global bir metilasyon çalışması yapılmıştır. Bununla birlikte, global düzeyde Behçet ikizleri ile sağlıklı kontrol ikizleri arasındaki genomdaki beklenen 5-mdC: dC oranı 0.02 ile 0.05 arasında çıkmıştır. Sonuç olarak, Behçet sendromlu ikizler ile sağlıklı ikizler arasında fark olmadığı görüldü ve global metilasyonun hastalığın patolojisinde etkili olmayabileceği düşünüldü. Bu çalışmanın en temelinde, epigenetik mekanizmaların etkilerini BS'de anlamak için grubumuzda tum genomu iceren global bir metilasyon çalışması yapılmıştır. Bununla birlikte, global düzeyde Behçet ikizleri ile sağlıklı kontrol ikizleri arasındaki genomdaki beklenen 5-mdC: dC oranı 0.02 ile 0.05 arasında cikmistir. Sonuç olarak, Behçet sendromlu ikizler ile sağlıklı ikizler arasında fark olmadigi goruldu ve global metilasyonun hastalığın patolojisinde etkili olmayabileceği düşünüldu. Daha sonra metilasyon profilinin HLA-B51 alleli, allel spesifik metilasyonun hastalığın patolojisinde rol oynayabileceğini dikkate alarak Behçet sendromlu ikizler ile sağlıklı ikizler arasında çalışma yapılmıştır. Mevcut biyoinformatik çalışmalar, HLA-B51 antijeninin promotor bölgesinden başlayan ve üçüncü intrönün ortasına kadar uzanan bir CpG adasını belirtmektedir. HLA-B geninin metilasyon seviyelerinin, HLA-B geninin 1. ekzon, 1. intron, 2. ekzon, 2. intrön ve 3. ekzon bölgelerinde ve Behçet hastalığının etiyolojisinde araştırılmıştır. Bu çalışmanın sonucunda 4 monozigot ve 4 dizigot Behçet sendromlu ikizin HLA-B geninin 1. ve 2. ekzonlarının epigenetik regülasyonu olabileceği ortaya çıkmıştır. Daha sonra metodun metilasyon profilinin HLA-B51 alleli, allel spesifik metilasyonun hastalığın patolojisinde rol oynayabileceğini dikkate alarak Behçet sendromlu ikizler ile sağlıklı ikizler arasında calisma yapilmistir. Mevcut biyoinformatik çalışmalar, HLA-B51 antijeninin promotör bölgesinden başlayan ve üçüncü intronun ortasına kadar uzanan bir CpG adasını belirtmektedir. HLA-B geninin metilasyon seviyelerinin, HLA-B geninin 1. ekzon, 1. intron, 2. ekzon, 2. intron ve 3. ekzon bölgelerinde ve Behçet hastalığının etiyolojisinde araştırılmistir. Bu çalışmanın sonucunda 4 monozigot ve 4 dizigot Behçet sendromlu ikizin HLA-B geninin 1. ve 2. ekzonlarının epigenetik regulasyonu olabilecegi ortaya çıkmıştır. Bu çalışmadan sonra ailesel BS ve sağlıklı aile bireyleri üzerine HLA-B51 allelinin genetik ve epigenetik etkilerinin daha iyi anlaşılması için çalışma yapılmıştır. Tüm BS bireylerinin metilasyon oranları sağlıklı akrabalarından daha yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte, bütün gruplar ayrı ayrı incelendiğinde, HLA-B51 taşıyıcılığının metilasyon seviyeleri üzerinde anlamlı bir fark oluşturmadığı bulunmuştur. Elde edilen bu sonuçlar, Behçet ikizleri ile önceki çalışmalarımızın sonuçlarıyla tutarlı olarak bulundu. Bu bilgiler ile HLA-B51 allelinden bağımsız muhtemel epigenetik mekanizmaların hastalığın gelişiminde etkili olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmadan sonra ailesel BS ve sağlıklı aile bireyleri üzerine HLA-B51 allelinin genetik ve epigenetik etkilerinin daha iyi anlaşılması icin calisma yapilmistir. Tüm BS bireylerinin metilasyon oranları sağlıklı akrabalarından daha yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte, bütün gruplar ayrı ayrı incelendiğinde, HLA-B51 taşıyıcıliginin metilasyon seviyeleri üzerinde anlamlı bir fark oluşturmadığı bulunmuştur. Eldeedilen sonuclar, Behçet ikizleri ile önceki çalışmalarımızın sonuçlarıyla tutarlı olarak bulundu. Bu bilgiler ile HLA-B51 allelinden bağımsız muhtemel epigenetik mekanizmaların hastalığın gelişiminde etkili olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada, sporadik Behçet sendromlu ve sağlıklı bireylerde HLA-B51 alel taşıyıcısı, HLA-B geninin ekspresyon seviyesi ve HLA-B geninin promotor metilasyonu araştırılmıştır. Bu amaçla bireysel BS hastaları rasgele seçilmiş ve bireye ailesi ve akrabaları arasında yalnızca kendisinde BS olup olmadığı sorulmuştur. Bu kritere göre 46 BS hastası seçilmiştir. Bu hastaların HLA-B51 taşıyıcılık durumlarını belirlemek için diziye ozgu PZR (Polimeraz zincir reaksiyonu) ve ardından enzim kesimi reaksiyonu gerçekleştirildi. Bu yöntemle sınıflandırılan BS hastalarında HLA-B'nin transkript düzeylerini ölçmek için RT-QPCR yöntemi kullanılmıştır. RT-QPCR ile elde edilen delta Ct değerleri, istatistiksel analiz için t testi kullanılarak gruplar arasında karşılaştırıldı. HLA-B51 tasiyicisi ve yüksek HLA-B ekspresyonu olan 6 hasta, HLA-B51 tasiycisi olmayan ve düşük HLA-B51 ekspresyonu olan 6 hasta ile HLA-B51 tasiyicisi ve yüksek HLA-B ekspresyon düzeyine sahip 5 sağlıklı kontrol, HLA-B51 ekspresyonu olmayan ve düşük HLA-B51 tasimayan ve HLA-B ekspresyonu dusuk 6 saglikli kontrol, HLA-B promotorunun metilasyon farklılıklarını görmek için RT-QPCR temelli Q-metil Kiti ile calisilmistir. Butun calışmaya BS hastalarıyla karşılaştırmak için 17 sağlıklı kontrol dahil edilmistir. Bu çalışmada 34 sporadik BS bireyin HLA-B51 pozitif olduğu ve 12 sporadik BS bireyin HLA-B51 negatif olduğu saptanmıştır. Sağlıklı kontrollerde 11 hasta HLA-B51 pozitif, 6 kişi HLA-51 negatif bulundu. İstatistiksel analiz sonuçlarına göre, transkript seviyeleri, farklı grup kombinasyonları arasında karşılaştırılmıştır. BS hastalarında HLA-B transkript seviyesinin sağlıklı kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu saptanmıştır (p = 0.0391). HLA-B51 için pozitif olan BS hastalarında, HLA-B51 için negatif olan BS hastalarına kıyaslaHLA-B'nin promoter metilasyon seviyesinin daha düşük olduğu saptanmıştır (p = 0.02080). Ayrıca bu karşılaştırmada, HLA-B'nin transkript seviyesi ve HLA-B'nin promoter metilasyon seviyesinin HLA-B51 tasiyan BS hastalarinda negatif korelasyon gosterdigi bulunmustur (r= -0895). Bu çalışmada, sporadik Behçet sendromlu ve sağlıklı bireylerde HLA-B51 allel taşıyıcılığı, HLA-B geninin ekspresyon seviyesi ve HLA-B geninin promotor metilasyonu araştırılmıştır. Bu amaçla bireysel BS hastaları rastgele seçilmiş ve bireye ailesi ve akrabaları arasında yalnızca kendisinde BS olup olmadığı sorulmuştur. Bu kritere göre 46 BS hastası seçilmiştir. Bu hastaların HLA-B51 taşıyıcılık durumlarını belirlemek için diziye özgü PZR (Polimeraz zincir reaksiyonu) ve ardından enzim kesimi reaksiyonu gerçekleştirildi. Bu yöntemle sınıflandırılan BS hastalarında HLA-B'nin transkript düzeylerini ölçmek için RT-QPCR yöntemi kullanılmıştır. RT-QPCR ile elde edilen delta Ct değerleri, istatistiksel analiz için t testi kullanılarak gruplar arasında karşılaştırıldı. HLA-B51 taşıyıcısı ve yüksek HLA-B ekspresyonu olan 6 hasta, HLA-B51 taşıycisi olmayan ve düşük HLA-B51 ekspresyonu olan 6 hasta ile HLA-B51 taşıyıcısı ve yüksek HLA-B ekspresyon düzeyine sahip 5 sağlıklı kontrol, HLA-B51 ekspresyonu olmayan ve düşük HLA-B51 taşımayan ve HLA-B ekspresyonu düşük 6 sağlıklı kontrol, HLA-B promotorunun metilasyon farklılıklarını görmek için RT-QPÇR temelli Q-metil kiti ile çalışılmıştır. Bütün çalışmaya BS hastalarıyla karşılaştırmak için 17 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Bu çalışmada 34 sporadık BS bireyin HLA-B51 pozitif olduğu ve 12 sporadık BS bireyin HLA-B51 negatif olduğu saptanmıştır. Sağlıklı kontrollerde 11 hasta HLA-B51 pozitif, 6 hasta HLA-51 negatif bulundu. İstatistiksel analiz sonuçlarına göre, transkript seviyeleri, farklı grup kombinasyonları arasında karşılaştırılmıştır. BS hastalarında HLA-B transkript seviyesinin sağlıklı kontrol grubuna göre daha yüksek olduğu saptanmıştır (p = 0.0391). HLA-B51 için pozitif olan BS hastalarında, HLA-B51 için negatif olan BS hastalarına kıyasla HLA-B'nin promoter metilasyon seviyesinin daha düşük olduğu saptanmıştır (p = 0.02080). Ayrıca bu karşılaştırmada, HLA-B'nin transkript seviyesi ve HLA-B'nin promotor metilasyon seviyesinin HLA-B51 taşıyan BS hastalarında negatif korelasyon gösterdiği bulunmuştur (r= -0895). Bu negatif korelasyon sonucuna göre promoter bölgesinin düşük metilasyon düzeyine sahip olması bu genin aktivitesi olduğunu ve beklendiği gibi bu genin transkript miktarının da yüksek olduğunu doğrulamıştır, Bu çalışmalar doğrultusunda HLA-B51 alleli taşıyan kişilerin sağlıklı kişilere göre promoter bölgesindeki metilasyon seviyesinin düşük olması bu bölgenin epigenetik açıdan önemli olabilecegini düşündürmektedir, İleride yapılacak olan çalışmalarda daha geniş bir hasta grubunda bu bölgedeki protein profili ikinci bir epigenetik kontrol basamağı olarak düşünüldügü zaman metilasyon profili ile birlikte değerlendirilmesi için ChIp deneyleri ile desteklenmelidir. .