İn vitro iskelet kas modelinin ortak-kültür aracılığıyla geliştirilmesi

İskelet kası kusurları çeşitli sebeplerden oluşabilir ve iskelet kas doku mühendisliği bu kaybın yeniden inşasını amaçlayan umut verici bir disiplinler arası yaklaşımdır. Kas dokusunun pedikül halinde yandaki ya da serbest halde uzaktaki kas dokusuna aktarılması, kas kusurlarının ve kayıplarının tedavisinde sıklıkla uygulanan bir yöntemdir, ancak, donör dokunun temin edilmesinin zor olması nedeniyle otolog greftleme için sınırlamalar vardır. İskelet kas dokusu mühendisliği, otolog öncü hücrelerden (kök hücreler) yeni kas dokusu üretimi sağlayarak bu sorunu çözmeye çalışır. İskelet kası dokusu mühendisliği uygulamaları için en çok tercih edilen hücre kaynakları, miyoblast hücre hattı ya da kas biyopsileri ile kolayca elde edilebilen ve in vitro kültürlenmiş uydu (satellit) hücreleridir. Nakledilen uydu hücreleri kas rejenerasyonuna katılabilir ve konakçı hayvanlarda uydu hücre popülasyonuna katkıda bulunurlar. Bu, uydu hücrelerini, kas dejenerasyonunda hücre bazlı transplantasyon tedavisi için mükemmel bir aday haline getirir. Kendi kendini yenilemenin yetersizliği, nakilden sonra donör hücrelerin kusurlu göçü, konakçının immün savunması ve hayatta kalma olasılığının azlığı, uydu hücrelerinin kliniklerdeki terapötik kullanımını etkileyen faktörlerdir. Uydu hücreleri, öncül hücre ve kök hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon olarak karakterize edilmiştir. Uydu hücresi hiyerarşisi hakkında tek hücre seviyesinde yapılacak daha kapsamlı bir araştırma gereklidir ve bunların performansı zamanla takip edilmelidir. In vivo işlevsellik içeren iskelet kası, vasküler, sinir, kas ve bağ dokuları gibi ana doku türlerinin indüksiyonunu gerektirir. Bundan böyle çeşitli kas dokuları; kas lifleri ve kasın tamamını kaplarken, iskelet kası kılcal damarlarla sarılır ve sinir dallarına bağlanır. Damarlanma, iskelet kası gibi yüksek oksijen ihtiyacı olan geniş dokularda önemli bir sorundur. Kas, oldukça metabolik bir organ olduğu için glikoz ve yağın depolanması ve parçalanmasından sorumludur. Ayrıca iskelet kası, egzersiz ve hiperinsülinemi sırasında artmış glukoz metabolizmasının sorumlu olduğu birincil dokudur. Bu kompleks sistemi in vitro koşullarda taklit etmek bir zorlu görevdir. Miyofiber, gelişme süresince birçok hücrenin birleşmesi ile oluşan geniş tek bir hücredir. Bu kas liflerinin bir araya toplanması kas oluşumuna neden olur. İskelet kası hücreleri motor nöronlar tarafından innerve edilir. Her nöron, az sayıda miyofiberi kontrol edebilir ve kasılmasına yardımcı olur. Miyogenez sırasında nöronal stimülasyona ihtiyaç vardır. Doku mühendisliği prensipleri yardımıyla, farklı kaynaklardan çok sayıda kök veya öncü hücreler kullanılarak farklılaştırılmış iskelet kası dokusu restore edilebilir. Vaskülarize edilmiş ve çok çekirdekli olgun kas liflerinin kendiliğinden rejenerasyonu, özelleşmenin sonlanması nedeniyle mümkün değildir. Uydu hücreleri veya miyoblastlar, yaralı kas dokusunun rejeneratif potansiyelini koruyabilir. Diğer dokularda da olduğu gibi, iskelet kasındaki damar ağı, giderek artan daha küçülerek dallanır. İskelet kasında, özelleşmiş arteriyol kas liflerine paralel çalışan kılcal damarlar oluşumlarına neden olur ve her kas lifi, bağımsız özelleşmiş arteriyollerin oluşturduğu kılcal gruplar tarafından beslenebilir. Kas dokusunun diğer paha biçilemez bileşeni olarak, motor nöronlar tarafından in vitro innervasyonun kurulması doğal dokuyu taklit ederek nöromüsküler kavşakları hedef alan ilaçların etkisini test etme fırsatı sağlar. Hem innerve hem de vaskülarize olan insan kas dokusu vücutta fonksiyonel dokuların oluşturulması için bize zaman kazandırırken, ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmalarında kullanıldığında hayvan temelli sistemler arasındaki değişkenleri de ortadan kaldırır. Bu çalışma, iskelet kası kökenli kök hücreler ve insan umbilikal damar endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak yeni bir insan kas dokusu modeli oluşturulması üzerine bir araştırma sunmaktadır. Bu çalışmada, İskelet kası kök hücrelerinin izolasyonu pre-plate yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Hücreler, astrosit belirteci glial fibriler asidik protein (GFAP) için negatif ve nöronal beta-tubulin III ve nestin için pozitif nöron-benzeri hücrelere farklılaştırılmıştır. Kılcal ağ ve çok çekirdekli miyotüp oluşumu, optimize konsantrasyonda fetal sığır serumu kullanımı ve uygun ortam koşulları altında iskelet kası kök hücrelerinin HUVEC'lerle birlikte ortak-kültürlenmesi ile sağlanmıştır. In vitro koşullarda uydu hücreleri, miyoblastlara olgunlaştırılmış ve birleşmeleri sağlanarak miyotüpler oluşturulmuştur. Kılcal ağ ve çok çekirdekli miyotüp oluşumu, fetal sığır serumu ve ideal ortam koşulları altında iskelet kası kök hücrelerinin HUVEC'lerle birlikte kültürlenmesiyle sağlanmıştır. Hücreler, miyojenik belirteç desmin ve endoteliyel belirteç CD31 için immünolojik olarak boyanmıştır. HUVEC'lerin,% 5,% 10 ve% 20 FBS ile takviye edilmiş bir DMEM / F12 ortamında hayatta kalmadığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, EGM-2 ortamı DMEM / F12 ile karıştırıldığında, HUVEC'ler hayatta kalmış ve çoğalmışlardır. Hem miyotüplerin hem de kılcal damar ağlarının oluşturulması için en iyi ortam kombinasyonu, DMEM / F12 (% 10 FBS): EGM-2 (% 2 FBS) (1: 1) karışımı olarak bulunmuştur. İnsan iskelet kası kök hücrelerinden üretilen nöron benzeri hücrelerin vaskülarize miyotüpler üzerine ekilmesi ile nöromüsküler kavşaklar oluşturulmuştur. Nöron benzeri hücrelerin, ortak- kültürden 24 saat sonra miyotüplerle temas ettiği bulunmuştur. İnsan iskelet kası kaynaklı kök hücrelerin (hSkMSC) sinirsel farklılaşmasını ve ortak-kültür koşullarında hücrelerin davranışını araştırmak için, hızlandırılmış zaman görüntüleme tekniği ile gerçek zamanlı gözlem yapılmıştır. Son olarak elektrofizyolojik çalışma ile çok çekirdekli hücrelerin kasılması faz kontrast mikroskopu altında gözlenmiştir. Bu çalışma, miyotüplerin ve nöronların etkileşimiyle geliştirilmiş kılcal ağlarla yeni bir in vitro insan iskelet kası modeli sunmaktadır. Bu model, ilaçların in vitro testinde ve ayrıca hücresel terapi yoluyla iskelet kaslarının yenilenmesi çalışmasında ya da hücre içeren doku mühendisliği biyomalzemeleri kullanılarak oluşturulacak kas yapılarının elde edilmesinde kullanılabilecektir.