22
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Archived Theses
Kronik lenfositik lösemi (KLL) - kücük lenfositik lenfoma (CLL/SLL) de immunglobulin geni varyant suptipleri, subklonları, mutasyonlar ve hastalık biyolojisi ile ilişkisine biyoinformatik yaklaşım
Kronik Lenfositik Lösemi (KLL) ve Küçük Lenfositik Lenfoma %30' a varan görülme sıklığı ile batı ülkelerinde en yaygın görülen yetişkin lösemidir. KLL klinik olarak fazlasıyla heterojenite gösteren bir hastalıktır. Bu nedenle KLL hastalarının bir kısmı tedavisiz uzun yıllar yaşarken bir kısmı ise tedaviye rağmen hastalığa yenik düşmektedir. KLL'de görülen bu heterojenitede; antijen uyarımı, IGHV genlerindeki somatik hipermutasyon durumu, B lenfositlerin mikroçevresindeki değişimler, genetik mutasyonlar ve epigenetik faktörlerin rol oynadığı düşünülmektedir. Dünya çapında pek çok çalışma, bu faktörlerden antijen uyarımı ile kuvvetli bir ilişkisi olan ve ''Stereotipik Subset'' olarak adlandırılan B lenfosit klonları üzerinde yapılmaktadır. Bu çalışmalar, KLL'nin heterojenliğini ve subsetlerin prediktif ve prognostik özelliklerini anlamak açısından önemlidir. Bu tez çalışmasında AÜTF Patoloji Anabilim Dalında, 2006-2021 yılları arasında Kronik Lenfositik Lösemi ve Küçük Lenfositik Lenfoma tanısı almış, 112 hastanın, Yeni Nesil Sekans teknolojisi ile IGHV gen bölgesi somatik hipermutasyon açısından incelenmiştir. Hastalar ile ilişkili olarak bulunan subsetler, IGHV veri tabanları başta olmak üzere del(11q), del(17p), Trizomi 12 ve del(13q) sitogenetik anomalileri ile karşılaştırılmıştır. Bu çalışmamızda ortaya konan bulguların büyük bir kısmının literatür ile benzer olduğunu saptadık. Bazı verilerin farklı olması, hastaların farklı coğrafik ve etnik kökenden olması ile ilişkilendirilebilir. Bu çalışmada Türkiye coğrafyasındaki bir grup KLL/SLL hastasının IGHV genlerinin dağılımı, somatik hipermutasyon durumu, subsetlerin belirlenmesi ve bunların sitogenetik anomaliler ile birlikteliğini ortaya konmuştur. Ülkemizde KLL hastalığının daha iyi anlaşılması açısından bu tip çalışmaların artması ve uluslararası veri tabanları ile karşılaştırılması yüksek önem içermektedir.
Development of a molecularly imprinted electrochemical sensor for the selective and sensitive detection of the anti-cancer drug ibrutinib
Ibrutinib (IBR) is a Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) inhibitor that is being used to treat refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) and mantle cell lymphoma (MCL). In this study, an electrochemical sensor was developed using a molecularly imprinted polymer on a glassy carbon electrode for the selective and sensitive detection of IBR. A polymeric film was obtained on the glassy carbon electrode surface by photopolymerization method using template molecule IBR, 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA), and ethylene glycol dimethacrylate (EGDMA) in the presence of functional monomers i.e., 4-aminobenzoic acid. The characterization of the sensor was investigated using scanning electron microscopy and electrochemical impedance spectroscopy. The parameters i.e., Monomer-template ratio, removal time, removal solutions, and incubation time, affecting MIP were optimized. The non-imprinted polymer (NIP) was prepared to act as a control. The electrochemical behavior of the designed sensor was investigated using the voltametric technique. For the first time, a MIP-based electrochemical sensor was developed for the determination of IBR which proved to be highly selective and sensitive with an imprinting factor of 3.71 for IBR with such low LOD and LOQ values 6.13×10-14 and 2.04×10–13 M, respectively. Detection of IBR was investigated in serum sample and tablet form. The findings demonstrated that the molecular imprinting approach in IBR detection is a highly effective technique that maximizes the potential of the newly developed sensor.
Yumurtalık kanserinde vulpinik asit'in ilaç adayı molekül olarak terapötik etkinliğinin belirlenmesi
Yumurtalık kanserleri, gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde jinekolojik kanserler içinde en önemli mortalite nedeni olmaya devam etmektedir. Kadınlarda görülen kanserler arasında en sık görülen beşinci kanser olup, kadınlardaki kanser ölümlerinde ise dördüncü sırada yer almaktadır. Prostat, yumurtalık ve meme kanserleri heterojen yapıya sahiptir ve hasta da zaman içerisinde gelişen terapötik direnç sorunları ile karşı karşıyadır. Bu nedenle alternatif terapötik özellikli moleküllerin etkinliğinin belirlenmesi kanser hastaları için umut kaynağı olmaktadır. Gerçekleştirilecek çalışma, OVCAR-3 ve SKOV-3 ovaryum kanser hücreleri ile OSE ovaryum normal epitel hücresi üzerine, vulpinik asitin Xcelligence cihazı kullanılarak antiproliferatif etkisi değerlendirilecektir. Metastaz yapmış kanser hastalarında ilaç tedavisinin başarısı hücrelerin apoptoz geçirme yeteneklerini koruyabilmelerine dayanmaktadır. Dolayısıyla vulpinik asitin ovaryum kanseri hücreleri üzerinde ki hücre döngüsü analizi ve apoptotik etkisi flow-sitometre ile belirlenecektir. Ayrıca oluşan apoptotik etkinin mRNA boyutunda apoptoz yolağına ait 77 genin qRT-PCR ile ifade seviyesi belirlenip, western blot yöntemi ile protein boyutunda da doğrulaması yapılacaktır. Elde edilen sonuçlara göre, vulpinik asitin ovaryum kanserinde umut verici aday molekül olarak kullanım etkinliğinin belirlenmesi öncelikli olarak mümkün olacaktır. Dahası biyolojik kökenli doğal bir molekülün hastalarda yan etki oluşturmayan potansiyeli ileri de klinik uygulamalar ile desteklenerek yumurtalık kanseri tedavisinde ilaç olarak kullanım desteği sağlanmasının önü açılmış olunacaktır.
Sıçan pankreatik beta hücre hattında (INS-1E) lipotoksisiteye verilen cevapta fonksiyon gösteren parkin proteininin regülasyonunda rol alan mikroRNA'ların saptanması
Tip 2 diyabet (T2D); hiperglisemiye neden olan, periferal insülin direnci ve pankreatik beta (β) hücrelerinden bozulmuş insülin salınımı ile karakterize endokrin ve metabolik bir bozukluktur. Endoplazmik Retikulum (ER) ve Mitokondriyon'da (Mt) oluşan problemler sonucu bozulan lipit ve kalsiyum homeostazı, ER stresi, Mt fonksiyon bozukluğu, ER ve Mt arası iletişim bozuklukları, otofaji mekanizmasının bozulması ve T2D sürecinde; insülin direnci ve pankreatik β hücre fonksiyon kaybı olarak kendini göstermektedir. Park2 geninin ürünü ve bir E3 ubikuitin protein ligaz olan Parkin proteini otofaji ve mitofajiye aracılık eden aynı zamanda sahip olduğu ubikuitinasyon yeteneği sayesinde; DNA onarımı, transkripsiyon, translasyon, organel trafiği, proliferasyon, inflamasyon ve hücre ölüm/sağkalım yolaklarında aktif rol almaktadır. İnsülin direnci ve T2D'in en temel nedenlerinden olan lipotoksisiteye karşı Parkin proteininin hücre sağkalımını otofaji üzerinden desteklediği, Parkin proteininin yokluğunda ise hücrenin apoptoza yönelim gösterdiği bilinmektedir. Minimal lipotoksisite farklılıklarında Park2 geni ifade düzeyi ve proteinin fonksiyonunda hızlı değişimler meydana gelmektedir. Bu durum Parkin protein regülasyonunun hızlı hareket eden RNA interferans (RNAi) mekanizması üyesi mikroRNA'lar (miRNA) ile düzenlenebileceği hipotezini ortaya çıkarmıştır. Buradan yola çıkarak bu tez çalışmasında biyoinformatik yaklaşımlar ve deneysel analizler bir arada kullanılarak ER ve Mt'de organel stresine neden olan palmitik asitle (PA) oluşturulan lipotoksik koşullarda Parkin proteini varlığında ve siRNA aracılı olarak Park2 geninin sessizleştirildiği koşullarda pankreatik beta hücrelerinde meydana gelen miRNA ifade farklılıkları incelenmiştir. Gerçekleştirilen miRNA profillemesi ve yapılan ileri biyoinformatik analizler ile validasyon çalışmaları sonunda hücre sağkalımında rolü olan Parkin proteininin regülasyonunda görev aldığı düşünülen rno-miR- 96-5p, rno-miR-153-3p, rno-miR-30e-3p ve rno-miR-344a-5p miRNA'ları öne çıkmıştır. Bu miRNA'ların özellikle, hücre sağkalım, otofaji, apoptoz, T2D ve insülin sinyalizasyon yolaklarında etkin olduğu gösterilmiştir. Aday miRNA'ların hedeflediği genlerin ifadelerinin validasyonları için gerçekleştilen Gerçek Zamanlı PZR çalışmaları da seçilen miRNA'ların bu süreçteki düzenleyici rollerini destekler niteliktedir.
Farelerde DNA aşısı ile oluşturulan mavidil serotip 4'e spesifikbağışıklık yanıta ilişkili miRNA profilinin belirlenmesi
Mavidil virusu, dünya çapında ciddi ekonomik kayıplara sebep olan Culicoides cinsi sivrisinekler ile bulaşan koyun, keçi ve diğer ruminantların ciddi hemorajik hastalığının etkenidir. Mavidil hastalığı, WOAH (World organisation of animal health) tarafından listelenmiş ihbarı mecburi hastalıklar sınıfında yer almaktadır. Vektör kaynaklı hastalıkları kontrol altına almak için en etkili önlem stratejisi aşılamadır. Bu çalışmada, Mavidil virusunun immunodominant özellikteki VP2 ve VP5 bölgesi için Rekombinant DNA teknolojisi kullanılarak Mavidil serotip 4 virüsünün ilgili proteinleri olan VP2 veya VP5 içeren iki farklı DNA aşısı geliştirilmesi ve immunizasyon sonrasında virusa ait miRNA profillemesi yapılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, VP2 ve VP5 proteinlerinin açık okuma çerçevesi, DNA aşı vektörü olarak kullanılan pcDNA3.1 vektörüne klonlanarak ve proteinlerin ifade olması sağlanarak iki DNA aşısı geliştirilmiştir. Geliştirilen pcDNA3.1- VP2 ve pcDNA3.1-VP5 aşı adayları farelerin immünizasyonunda kullanılmıştır. Virusun ilgili bölgelerine spesifik ELISA pleyti geliştirilerek indirekt ELISA testi ile nötralize edici antikor yanıtı oluşturduğu belirlenmiştir. Hücresel bağışıklığın belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilen flow sitometri sonucunda, aşılanmış farelerde kontrol grubuna göre Th2 hücreleri tarafından salgılanan IL-4 ve IL-10 sitokinlerinde anlamlı düzeyde (p<0.05) artış gözlemlenmiştir. Tezin ikinci aşamasında, mavidil serotip 4'e ait miRNA ifade profillemesi yapılarak 22 adet miRNA'da qRT-PZT ile istatistiksel olarak artış ve azalışlar tespit edilmiştir.
Nadir mutasyonların taramasına yönelik derin dizileme çalışmaları için çok boyutlu havuzlama yaklaşımının geliştirilmesi ve familyal hiperkolesterolemi hasta grubunda uygulanması
DNA dizi analizine dayanan testler düşük maliyetli olmamaları sebebiyle günümüzde genetik hastalıkların geniş kitlelerde taramasında sınırlı olarak kullanılabilmektedirler. Havuzlama yaklaşımı maliyet düşürücü etkisi sayesinde özellikle hastalık tarama programlarında tercih edilmektedir. Yeni Nesil Dizileme (YND/NGS) teknolojisinin havuzlama yaklaşımı ile birlikte kullanılması, genetik hastalıkların toplum çapında taranması önündeki en büyük engel olan maliyet problemine çözüm sağlayarak, kitlelerin genetik hastalıklarının DNA dizileme ile taranmasında kullanılabileceği öngörülmektedir. Bu tez çalışmasında 2 ve 3 boyutlu farklı havuzlama yaklaşımları, basitlik ve kullanım kolaylığı ön planda tutularak test edilmiş, elde edilen sonuçlara göre seçilen 2 boyutlu 8x8'lik havuzlama ile 256 adet FH hastası ve 64 adet kontrol örneğinin 6 geni NGS teknolojisi kullanılarak nadir varyasyonlar açısından taranmıştır. Çalışma kapsamında denenen havuzlama yaklaşımları arasından 2 boyutlu 8x8 ve 16x16'lık havuzlamalar başarılı, 24x24'lük havuzlama ise kısmen başarılı olarak değerlendirilmiştir. Daha yüksek havuzlamalar ise başarısız olarak değerlendirilmiştir. Taranan 320 adet örneğin 75'inde, 40 farklı mutasyondan toplam 89 adet genotip tespit edilmiştir.
Sendromik olmayan dudak damak yarıklı bireylerde Wnt sinyal yolağında fonksiyon gören genlerin değerlendirilmesi
Dudak damak yarıkları insanlarda en sık görülen kraniyofasiyal malformasyonların başında gelir. Her hangi bir sendrom ve/veya sistemik hastalığa eşlik edebileceği gibi, sendromlardan bağımsız olarak da gözlenebilir. Sendromik olmayan dudak damak yarıkları multigenik ve çevresel faktörlerde ortaya çıktıkları için sıklıkla araştırma konusu olmaktadırlar. Araştırmalarda pek çok aday gen üzerinde durulmakta, ancak somut bir sonuç elde edilememektedir. Bu çalışmanın amacı, aday genlerin, dudak damak yarıklarının oluştuğu prenatal dönemde çok etkin olduğunu bildiğimiz Wnt sinyal yolağında fonksiyon gören tüm genlerin incelenmesidir. Araştırmamıza Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Ortodonti Anabilim Dalında tedavileri devam etmekte olan, yaşları 12 yıl 3 ay ile 20 yıl 3 ay arasında değişen 6 kadın, 4 erkek sendromik olmayan dudak damak yarığına sahip birey dahil edilmiştir. Bu bireylerden alınan kan numuneleri ile Wnt sinyal yolağında fonksiyon gördüğü tespit edilmiş olan 500 genin ekzomları ile panel oluşturulmuştur. Çalışmaya dahil edilen tüm bireylerde mevcut olan varyantlar ve ACMG (Amerikan Tıbbi Genetik ve Genomik Koleji) sınıflandırmasına göre patojenite durumları tespit edilmiş ve yorumlanmıştır. Çalışmaya dahil edilen 500 genin 235'inde 451 çeşit varyant bulunduğu tespit edilmiştir. Bu varyantlardan 28 tanesinin üç ve daha fazla kez hastalarda tespit edildiği gözlenmiştir. Varyant gözlenen 235 genden CBS'de toplam 54, MAP2K3'de 22, FANCD2'de 17, PKD1'de 11 ve MCC'de 10 varyant tespit edilmiştir. Çalışmaya dahil edilen bireylerden 4'ünde yüksek olasılıkla patojenite (LP) veya klinik önemi belirsiz değişiklik/ Yüksek olasılıkla patojenite (VUS-LP) varyantı tespit edilmiştir. İki bireyde 1 adet riskli varyant tespit edilirken, üçüncü bireyde 2, dördüncü bireyde ise 3 riskli varyant kaydedilmiştir. Ancak bu varyantlar dudak damak yarıklarıyla ilişkili genlere ait bulunmamıştır. Wnt sinyal yolağıyla daha önceki yıllarda yürütülen çalışmalar bu araştırmaya öncülük etmiş olsalar da, çalışmamızda Wnt sinyal yolağındaki genlerin dudak damak yarığında çok büyük bir etkinliği olduğu gösterilememiştir. Bu araştırmanın sonucunda, en fazla varyant bulunan CBS (cystathionine beta-synthase) geni ile ilgili daha detaylı çalışmalar yapma ihtiyacı doğmuştur.
Lokal agresif iğsi hücreli tümörlerde, tedavi hedefi olan NTRK mutasyonlarının dağılımının patogenez ile ilişkisinin araştırılması
NTRK gen füzyonları, sık karşılaşılan tümörlerde nadir görülen ancak, tedavi hedefi olan genomik değişikliklerdir. NTRK füzyonarını hedefleyen tirozin kinaz inhibitörleri FDA'nın onay verdiği ikinci tümör ve doku agnostik ilaç olamsı bakımından büyük önem taşımaktadır. Güncel literatürde NTRK füzyonarının farklı tümör gruplarında hangi yöntem ve hangi algoritmayı kullanarak araştırılması gerektiği en büyük sorunu oluşturmakta ve halen güncel olarak tartışılmaktadır. Bu tez çalışmasında, yumuşak dokunun lokal agresif iğsi hücreli tümörleri grubuna dahil olan 17 Dermatofibrosaroma protuberans (DFSP), 30 Soliter fibröz tümör (SFT) ve 29 İnflamatuar myofibroblastik tümör (İMT) vakasında NTRK gen füzyonu varlığı araştırılmıştır. Bu araştırma için literatürde kullanılan immünhistokimya (IHK), floresan insitu hibridizasyon (FISH) ve hedeflenmiş RNA dizileme (RNA-Seq) yöntemleri kullanılmıştır. Ayrıca literatürden faklı olarak kantitiatif revers transkritaz polimeraz zincir reasksiyonu (qRT-PCR) analizinde 3'5' imbalance analizi ile füzyon tespiti yapılıp yapılamayacağı irdelenmiştir. Sayılan bu dört yöntem içerisinden en ideal yöntemin ne olacağı belirlenmeye çalışılmıştır. Her dört yöntemin birlikte değerlendirmesinde 17 DFSP vakası içerisinde fibrosarkomatöz transformasyon gösteren 1 (%5,8) vakada, santral sinir sistemi yerleşimli 9 SFT vakasının 2'sinde (%22,2) ve 29 İMT vakasının 1'inde (%3,4) NTRK gen füzyonu tespit edilirken, periferik yerleşimli 21 SFT vakasının hiçbirinde NTRK gen füzyonu izlenmemiştir. Yöntemlerin birbirleri ile kıyaslanması sonucunda NTRK gen füzyonunun eski arşiv materyalnden incelenmesi durumunda en ideal yöntemin FISH analizi olduğu, RNA tabanlı olan NGS yönteminin negatif prediktif değerlerinin düşük olması nedeni ile çok ideal bir yöntem olmadığı sonucuna varılmıştır. İmbalance analizinin son 2 yıllık arşiv materyalinde daha sağlıklı sonuçlar verdiği görülmüş, primer sayısı arttırılarak geliştirilebilmesi halinde NTRK gen füzyonu saptamada alternatif bir yöntem olarak kullanılabileceği düşünülmüştür.
Rekombinant immunoglobulin G1 monoklonal antikorununKluyveromyces lactis maya ekspresyon sistemi kullanılarak üretimi
Hedeflerine yüksek afinite ile bağlanan monoklonal antikorlar, pek çok hastalığın tedavisinde önemli rol oynamaktadır. Son yıllarda, rekombinant DNA teknolojisindeki gelişmeler, hayvan aşılamasına gerek kalmadan monoklonal antikor üretimini mümkün hale getirmiştir. Memeli hücreleri gibi yaygın kullanılan platformların yanı sıra K.lactis gibi maya türleri de rekombinant protein üretimi için ön plana çıkmaktadır. Bu tez çalışmasında, K.lactis maya ekspresyon sistemi kullanılarak yaklaşık 150 kDa büyüklüğünde tam boyutlu trastuzumab üretilmiş ve hücre dışına salgılanması sağlanmıştır. Hafif ve ağır zincir dizileri başarılı bir şekilde pKLAC2 vektörüne klonlanmış ve K.lactis hücrelerine elektroporasyon yoluyla aktarılmıştır. Laktoz içeren BMLY besiyerinde indüklenen kültürde, hafif ve ağır zincir transkriptlerinin başarıyla üretildiği doğrulanmıştır. Trastuzumabın saflaştırılması için amonyum sülfat presipitasyonu ve hidrofobik etkileşim kromatografisi yöntemleri kullanılmıştır. SDS-PAGE ve western blot analizleri ile tam boyutlu trastuzumabın başarıyla üretilip hücre dışına salgılandığı doğrulanmıştır. Ayrıca, MCF7 hücre lizatı kullanılarak, saflaştırılmış trastuzumabın HER2 reseptörüne bağlanabildiği gösterilmiştir.
2 boyutlu nanomalzemelerin glioblastoma fotodinamik tedavisinde kullanımı
Glioblastoma (GBM), beyinde glial hücrelerden kaynaklanan oldukça agresif bir tür beyin tümörüdür. Glioblastoma için tercih edilen standart tedavi cerrahi rezeksiyon, eş zamanlı radyoterapi ve kemoterapidir. Bu tedavilerin ardından hastalık nüksetme eğilimi gösterirken ölümcül prognozlu, hastalarda sağ kalımı oldukça düşürmektedir. Böylesi ölümcül bir tümör ile mücadele edebilmek için alternatif tedavi metotlarının geliştirilmesi kaçınılmazdır. Bu ihtiyaç doğrultusunda, planladığımız bu tez çalışmasında fotodinamik tedavi için kullanımı tercih edilen iki boyutlu nanomalzeme grafitik karbon nitrit ve MXene türevi molibden titanyum karbür kullanılmıştır. Glioblastoma tedavisi için etkin fotosensitizer dozu ve ışığa maruz kalma süreleri belirlenerek, fotodinamik tedavi potansiyeli ortaya konulmuştur. Fotodinamik tedavi günümüzde LED ışık veya lazer aracılığıyla gerçekleştirilebilmektedir. Çalışmamızda ışığın kanserli alana özgü olarak iletilebilmesi için; beyne implante edilebilen, biyouyumlu hidrojel mikroakışkan optik fiberler üretilmiştir. Bu sayede daha yüksek ışık kalitesi ve daha iyi optik hizalama amaçlanmıştır. Üretilen mikroakışkan optik fiberlerin optik ve mekanik karakterizasyonlarının yanı sıra ex-vivo etkinlik testleri gerçekleştirilmiştir. Bu sonuçlar ışığında; ülkemizde ilk defa glioblastoma tedavisinde 2 boyutlu nanomalzeme grafitik karbon nitrit ve MXene kullanılarak pre-klinik aşamada fotodinamik tedavi protokolü oluşturulmuştur. Literatürde ilk defa beyne implante edilebilen fiber optik kablo ile kombine edilebilen mikroakışkan hidrojel optik fiber aracılı fotodinamik tedavi amacıyla biyomalzeme üretilmiş ve test edilmiştir.