261
Archived Theses
0
DOIs Assigned
0%
DOI Rate
Discipline
Sıçanlarda travmatik beyin hasarının testise olası etkilerinin araştırılması
Amaç:Çalışmamızda ağırlık atışı modelini kullanarak oluşturduğumuz travmatik beyin hasarının testis üzerine etkisi olup olmadığını araştırmayı amaçladık.Yöntem:Deney gruplarımız aşağıdaki gibi oluşturuldu:Grup I, Kontrol grubu: Hiçbir hasara maruz bırakılmayan deney grubudur. (n=7)Grup II, Travma grubu: Ağırlık atışı modeliyle travmatik beyin hasarına maruz bırakılan grup. (n=7)Travmanın kanıtlanması amacıyla, deneyden 24 saat sonra sakrifiye edilen deneklerden alınan beyin dokularından kesitler alınarak, cresyl violet boyaması yapıldı. Boyama yapılan kesitlerde hücre sayımı gerçekleştirildi. Alınan diğer doku olan testislere ise histokimyasal değerlendirme amacıyla H&E, PAS ve Masson Trikrom boyamaları yapıldı. İmmünohistokimyasal olarak TUNEL ve Aktif Kaspaz 3 boyaması yapılarak apoptoz değerlendirildi. Elektron mikroskobik olarak testislerin ince yapısı incelendi.Sakrifikasyon esnasında deneklerden alınan kan örnekleriyle GnRH, testosteron, LH, FSH hormon seviyeleri ve MDA, GPx seviyeleri değerlendirildi. Sonuçlar istatistiksel olarak gruplar arasında karşılaştırıldı.Bulgular:Kontrol grubunun histolojik olarak değerlendirilmesinde testis dokusu normal gözlendi. Seminifer tübüller içinde tabakalanmış spermatogenik seri hücreleri, intertisiyel alanda bulunan leydig hücreleri ve bağ doku hücreleri, dokuyu etrafından saran düzensiz sıkı bağ dokusu tunika albuginea gözlemlendi.Travma grubunda ise histolojik olarak değerlendirme yapıldığında spermatogenik seri hücre sayılarında azalma gözlendi.TUNEL boyamasında DNA fragmantasyonu değerlendirildiğinde kontrol grubu da dahil olmak üzere apoptoz görüldü. Grup II'de Grup I'e kıyasla daha fazla sayıda TUNEL pozitif hücrelerin bulunduğu saptandı.Sonuç:Çalışmamızda travmatik beyin hasarının testis üzerine olan etkisi histokimyasal, immünohistokimyasal, ultrastrüktürel ve biyokimyasal olarak incelendi. Travmatik beyin hasarının tübüllerde hasar oluşturduğu ve apoptoz oranında artışa neden olduğu gözlemlendi.Ancak travmatik beyin hasarının testise olası etkileriyle ilgili literatürde çalışma bulunmadığından daha farklı ağırlıklar kullanılarak çalışmaların artırılması ve araştırılması gerekmektedir.
L-karnitin'in sıçanlarda oluşturulan testiküler hipertermide koruyucu etkilerinin araştırılması
Amaç:Çalışmamızda hiperterminin testiste oluşturduğu hasara karşı L-karnitin'in koruyucu etkisini histokimyasal, immünohistokimyasal, ultrastrüktürel ve biyokimyasal olarak incelemeyi amaçladık.Yöntem:Deneysel modelimizde Wistar suşu erkek sıçanlar 3 gruba (n=7) ayrıldı. Kontrol grubu; 5 gün, günde 15 dakika, 22°C (oda sıcaklığı) su banyosu uygulanan grup. Hipertermi grubu; 5 gün, günde 15 dakika, 43°C sıcak su banyosu uygulanan grup. L-karnitin grubu; 250 mg/kg/gün L-karnitin'in hipertermi uygulamasından 1 saat önce ve 5 gün süre ile intraperitoneal yöntemle verildiği grup. Tüm denekler 5 günlük deney uygulanmasından 14 gün sonra sakrifiye edildi. Histokimyasal incelemeler için hematoksilen & eozin (H&E), masson trikrom ve periyodik asit schiff (PAS), immünohistokimyasal olarak da apoptozun belirlenmesi için TUNEL ve aktif kaspaz-3 boyamaları yapıldı, testis ince yapısı ultrastrüktürel düzeyde incelendi. Biyokimyasal incelemeler için doku homojenatlarında süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx) ve malondialdehit (MDA) düzeyleri incelendi.Bulgular:Yapılan histokimyasal ve ultrastrüktürel incelemelerde kontrol grubunda normal testis yapısı gözlendi. Hipertermi grubunda seminifer tübüllerinde vakuolizasyon, germ hücre kaybı ve intertisyel alanda bağ doku artışı gözlendi. L-karnitin grubunda ise normale yakın morfolojide testis yapısı gözlendi. Yapılan immunohistokimyasal incelemeler sonucu hipertermi grubu seminifer tübüllerinde kontrol grubuna oranla TUNEL (+) boyanan hücre sayısının ve aktif kaspaz-3 immunpozitif boyanan hücre sayısının arttığı, koruyucu olarak L-karnitin verilen grupta ise immunpozitif boyanan hücre sayısının azaldığı gözlendi. Biyokimyasal olarak MDA, GPx ve SOD düzeyleri hipertermi grubunda kontrol grubuna oranla anlamlı olarak yüksek, L-karnitin grubuna kıyasla ise yine yüksek bulundu fakat istatistiksel olarak anlamlı değildi.Sonuç:Elde ettiğimiz verilere dayanarak testiküler hiperterminin testis de doku hasarı oluşturduğunu, oksidatif stresi ve apoptozu arttırdığını, koruyucu ajan olarak kullanılanL-karnitin'in oluşan doku hasarını ve biyokimyasal değişiklikleri azalttığını gözlemledik.Anahtar Kelimeler: hipertermi, L-karnitin, testis, apoptoz.
Anabolik androjenik steroid uygulanmış erkek sıçanlarda eritropoietinin testis üzerine koruyucu etkilerinin incelenmesi
ÖZETAMAÇBu çalışmada; anabolik androjenik steroid hormon olan nandrolone decanoate (ND) uygulanmış erkek sıçanlarda güçlü bir antioksidan olan eritropoietinin (EPO) testis dokusu üzerine etkilerinin histolojik, ultrastrüktürel, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak araştırılması hedeflenmiştir.YÖNTEMDeneysel modelimizde Wistar suşu erkek sıçanlar 5 gruba (n=7) ayrıldı. I. grup, kontrol grubu; II. grup, sham grubu; III. grup, 10 mg/kg/hafta Nandrolone decanoate (ND) verilen deney grubu, IV. grup, 10mg/kg/hafta ND ve Düşük doz (100 IU/kg) Eritropoietin (EPO) verilen deney grubu, V. grup, 10mg/kg/hafta ND ve Yüksek doz (500 IU/kg) EPO verilen deney grubu. Işık mikroskobik incelemeler için kesitler Hematoksilen&Eozin (H&E), Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı. İmmünohistokimyasal olarak apoptoz belirlenmesi için ise terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling (TUNEL) ve Kaspaz-3 boyamaları yapıldı. Biyokimyasal incelemer için alınan dokularda glutathion peroxidase (GPx) ve melondialdehit (MDA) düzeyleri incelendi.BULGULARYapılan çalışmalar sonucunda kontrol ve sham gruplarında normal testis yapısı gözlendi. ND grubunda spermatogenik seriye ait hücre diziliminde düzensizlik, germ hücre kayıpları, seminifer tübüllerde vakuolizasyon, tübül lümeninde spermiyum hücrelerinin azalması, bazılarında görülmemesi gibi bulgular gözlendi. Ayrıca bazal membranda kalınlaşma gözlendi. Epo gruplarında ise kontrol grubuna yakın sonuçlar elde edildi. İmmünohistokimyasal incelemelerde ND gurubu testis dokusunda kontrol grubuna göre anlamlı oranda immünpozitif hücre artışı gözlenirken Epo tedavi gruplarında kontrole yakın değerler gözlendi. Biyokimyasal olarak kontrol ve sham gruplarıyla ND grubu kıyaslandığında MDA düzeylerinde anlamlı artış, GPx düzeylerinde ise anlamlı olarak azalma gözlendi. Tedavi gruplarında ise ND grubuna kıyasla MDA düzeylerinde anlamlı azalış, GPx düzeylerinde ise anlamlı artış saptandı.SONUÇElde ettiğimiz verilere dayanarak ND' nin testis dokusunda oksidatif stresi ve apoptozu arttırdığı, doku hasarı oluşturduğu fakat Epo' nun oluşan doku hasarını ve biyokimyasal değişiklikleri azalttığını gözlemledik.Anahtar Kelimeler: Anabolik androjenik steroid, nandrolone decanoate, Epo, testis, apoptoz.
Perflorododekanoik asidin testiste oluşturduğu hasara karşı resveratrolün koruyucu etkisinin araştırılması
Perflorododekanoik asit geniş endüstriyel uygulamaları olan, insan ve hayvan serumunda tespit edilen ve erkek üreme sistemi üzerine olumsuz etkileri olan 12 karbonlu sentetik kimyasaldır. Çalışmamızda perflorododekanoik asidin testiste oluşturduğu hasara karşı resveratrolün koruyucu etkisini histokimyasal, immünohistokimyasal, ultrastrüktürel ve biyokimyasal olarak incelemeyi amaçladık. 28 Sprague Dawley suşu erkek sıçanlar dört gruba ayrıldı. Kontrol grubu hiçbir müdahale yapılmayan grup. Sham grubu 14 gün boyunca alkol verilen grup. Asit Grubu: 14 gün boyunca oral gavaj ile 10 mg perflorododekanoik asit uygulanan grup. Resveratrol ve Asit Grubu 14 gün boyunca oral gavaj ile 40 mg resveratrol ve 10 mg perflorododekanoik uygulanan grup. Deney başlangıcında ve bitiminde bütün deneklerin ağırlıkları ölçüldü ve 14. Günde sakrifiye edildi. Histokimyasal incelemeler için hematoksilen ve eozin, masson trikrom ve periyodik asit schiff, immünohistokimyasal olarak apoptozun belirlenmesi için TUNEL ve Aktif Kaspaz 3 boyamaları yapıldı. Biyokimyasal incelemeler için doku homojenatlarında süperoksit dismutaz, glutatyon, malondialdehit ve serum testosteron düzeyleri incelendi. Ayrıca testis ince yapısı ultrastrüktürel düzeyde incelendi. Histolojik değerlendirmede kontrol ve sham gruplarına ait testis dokuları normal yapıda olduğu gözlenmiştir. Asit grubuna ait histokimyasal ve ultrastruktural incelemelerde, seminifer tübülde vakuolizasyon, spermatogenik hücrelerde azalma, interstisyel alanda bağ doku artışı ve kalınlaşmış bazal membran gözlenmiştir. Resveratrol ve asit grubunda ise normale yakın morfolojide testis yapısı gözlendi. İmmunohistokimyasal değerlendirmede, asit grubunda apoptatik hücre sayısında kontrol grubuna göre anlamlı artış gözlenmiştir. Resveratrol + asit gurubunda ise apoptatik hücre sayısında asit grubuna göre anlamlı azalma gözlenmiştir.Biyokimyasal sonuçlarda, asit grubuna ait MDA, GSH ve SOD seviyelerinde anlamlı değişiklikler gözlenmiştir. Asit grubuna ait serum testosterone seviyeleri kontrol ve sham grubuna göre anlamlı olarak azalmıştır. Elde ettiğimiz verilere dayanarak perflorododekanoik asidin testiste doku hasarı oluşturduğu, oksidatif stresi ve apoptozu arttırdığı, koruyucu ajan olarak kullanılan resveratrolün oluşan doku hasarını ve biyokimyasal değişiklikleri azalttığını gözlemledik.
EIS (Electrochemical ımpedance spectroscopy) metodunu kullanarak ICSI (Intra cytoplasmic sperm ınjection) ile oositin spermle uygun fertilizasyon zamanının araştırılması
Tüp bebek merkezlerinde uygun gamet seçimi için çok fazla zaman harcanmasına rağmen, günümüzdeki Yardımcı Üreme Teknikleri (YÜT) ya başarısızdır ya da düşük bir başarı yüzdesine sahiptir. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) tekniği, biyofizik ve kimya kökenli bir metodtur. Hücreler, sitoplazma ve organelleri ile biyofizik ve biyokimya kurallarına tamamen uyarlar. Bu birimler yapılarına dayanarak, özel direnç, potansiyel ve elektriksel davranışlara sahiptirler. Toplam 55 adet, 8-16 haftalık 220-250gr ağırlığında Wistar Albino rat Dokuz Eylül Üniversitesi?nin Deney Hayvanları Anabilim Dalından temin edildi (Grup A1, A2, A3 toplam 15 adet erkek) ve 40 adet dişi (B1, B2, B3). Vasektomi grubundaki (A2) 5 adet erkek rat deneyin 10 gün öncesi ketasol ile anestezi altında vasektomi yapıldı. Sperm aspirasyon grubundan (A1, A3) MESA yöntemi ile ICSI için sperm temin edildi. B1 ve B3 gruplarının östrus evresi smear yaymasıyla tespit edildi, süperovulasyon yapıldı ve oositleri toplandı. EIS yöntemiyle elektriksel potansiyel ölçümü için oosit boyutuna uygun mikroçip hazırlandı. YÜT kriterlerine göre seçilen oositlerin yarısı EIS ile değerlendirilirken diğer yarısına EIS uygulanmadı. Seçilen tüm oositlere ICSI yapıldı. Önceden hazırlanan dişi ratlara anestezi altında 3.gün 4 ile 14 embriyo transfer edildi. Tüm veriler istatistiksel olarak T-Student testi ve SPSS 15 programı ile değerlendirildi. EIS ile seçilen 58 oositin EIS kullanmadan seçilen 57 oosite göre; fertilizasyon oranı, embriyo transfer oranı daha başarılı olduğu görüldü. Bu çalışmada ratlarda fertilizasyon için uygun oositin `elektriksel EIS fertilizasyon penceresi?nin 118 ile 132 mV arasında olduğu ilk kez gösterildi.
Sıçanlarda gentamisin ile oluşturulan deneysel testis hasarı üzerine kuersetin'in etkileri
Bu çalışmada gentamisinin testis üzerinde meydana getirdiği değişiklikler ve oksidatif stresin rolünün belirlenmesi; antioksidan olan kuersetinin koruyucu etkilerinin olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Çalışmamızda 24 adet erişkin erkek Sprague Dawley cinsi sıçan 4 gruba ayrıldı ve deney süresi 7 gün olarak belirlendi. Kontrol grubuna deneyin 1. gününden başlanarak 7 gün boyunca günlük intraperitoneal (i.p.) serum fizyolojik uygulandı. İkinci grup olan gentamisin grubuna (GEN) 7 gün boyunca günlük 80mg/kg dozunda i.p. gentamisin verildi. Üçüncü grup olan kuersetin grubuna (QUE) da aynı şekilde 7 gün boyunca günlük 50 mg/kg kuersetin i.p. uygulandı. Dördüncü grup olan gentamisin+kuersetin grubuna (GEN+QUE) ise deneyin 1. gününden itibaren 7 gün boyunca günlük i.p. 50 mg/kg olacak şekilde kuersetin ve 80 mg/kg dozunda i.p. gentamisin verildi. Deneyin sonunda (8. günde) sıçanlar anestezi altındayken (i.p. ketamin 90 mg/kg) kansızlaştırma yoluyla sakrifiye edildi. Alınan kan örnekleri biyokimyasal parametreler için EDTA (etilen diamin tetra asetik asit)'li tüpe konuldu. Testis ve epididimis dokuları diseke edildi. Epididimden elde edilen sperm örneklerinden sperm sayısı, motilitesi, canlılığı ve morfolojisi analiz edildi. Elde edilen testis dokularının bir yarısından hematoksilen&eozin (H&E), Masson trikrom ve periyodik asit Schiff (PAS) boyama yöntemleriyle histopatolojik incelemeler yapıldı. Testis ve epididimisin doku örnekleri ışık mikroskobunda histopatolojik olarak incelendi. Testiste seminifer tübül hasar değerlendirmesi için Johnsen skorlama sistemi ve apoptozis değerlendirmesi için ise terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT)- deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling assay (TUNEL) tekniği kullanıldı. Testis dokularının diğer yarısında ise biyokimyasal olarak doku malondialdehit (MDA), doku süperoksit dismutaz (SOD), doku katalaz (CAT), doku glutatyon peroksidaz ve plazma MDA düzeylerine bakıldı. Yapılan değerlendirmeler sonucunda vücut ağırlığı ölçümlerinde QUE ve GEN+QUE grubunda istatistiksel olarak anlamlı azalma mevcut idi. Testis ağırlıklarının ölçümlerinde gentamisin uygulanan gruplarda kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı azalma gözlendi. Histopatolojik değerlendirmelerde GEN grubu testis dokusunda gözlenen germinal epitel kalınlığında azalma, Johnsen skorunda düşme, immatür hücre dökülen tübül oranı artışı ve değerlendirilen apoptotik indekste artış gibi bulgularda QUE eklenmesiyle düzelme olduğu izlendi. Yapılan sperm analizinde GEN grubunda sperm sayısının ve anormal morfolojiye sahip spermlerin kontrole göre arttığı, canlılık ve motilitenin azaldığı gözlendi. GEN+QUE grubunda QUE'nin sperm morfolojisi ve canlılığını artırdığı tespit edildi. Biyokimyasal parametrelerde de GEN grubunda MDA seviyesinde artma, SOD, CAT ve GPx seviyelerinde ise azalma tespit edildi. GEN+QUE grubunda ise GEN grubuna göre MDA seviyesinin azaldığı, SOD, CAT ve GPx düzeylerinin de arttığı gözlendi. Elde edilen bulgularımız gentamisinin testis yapısını ve fonksiyonunu bozduğunu, kuersetin tedavisinin ise bu olumsuz etkilenmeyi önleyebildiğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Gentamisin, Kuersetin, Testis, Apoptoz, Oksidatif stres Bu çalışma Karadeniz Teknik Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından desteklenmiştir. Proje numarası: TTU-2019-8461
Quercetinin, rosmarinik asitin ve quercetin & rosmarinik asit kombinasyonunun metotreksata bağlı testis hasarına etkileri
Araştırmamızda 40 adet Sprague Dawley cinsi erişkin erkek sıçan rastgele 5 eşit gruba ayrıldı. 7 günlük deney sürecinde Kontrol grubuna herhangi bir uygulama yapılmazken MTX, MTX+QT, MTX+RA ve MTX+QT+RA gruplarına deneyin 5. günü intraperitoneal yolla tek doz 30 mg/kg metotreksat uygulandı. Deney süresi boyunca her gün gavaj yoluyla; MTX+QT grubuna 30 mg/kg quercetin, MTX+RA grubuna 30 mg/kg rosmarinik asit, MTX+QT+RA grubuna ise 15 mg/kg quercetin ve 15 mg/kg rosmarinik asit verildi. Denekler 1, 4 ve 7. günlerde tartıldı. 7. günün sonunda anestezi altında sakrifiye edilen deneklerden alınan; kan örnekleri biyokimya tüplerine, sol epididimis dokuları tris tamponu içeren petri kaplarına, sağ epididimis dokuları %10'luk formaldehit solüsyonuna, sol testis dokularının bir yarıları Bouin solüsyonuna, diğer yarıları ise biyokimyasal incelemeler için eppendorf tüplerine koyuldu. Sol testis dokuları ikiye bölünmeden önce tartıldı. Yapılan tartımlar ve alınan örneklerle; vücut ve testis kütle analizleri, sperm analizleri, kan testosteron ve doku MDA, doku SOD, doku GPx, doku CAT ölçümleri, hematoksilen&eozin, Masson trikrom, periyodik asit Schiff ve TUNEL boyamaları yapıldı. Değerlendirilen veriler ışığında elde ettiğimiz sonuçlar; metotreksatın testiste fizyolojik, histopatolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak hasara neden olduğunu; verilen antioksidan tedavilerinin, bozulan parametrelerin neredeyse hepsinde, çoğu zaman kısmi bazen ise tama yakın düzeltmeler yaptığını gösterdi. Tedavi gruplarının bazı parametrelerde başarı konusunda birbirlerine üstünlük kurdukları gözlemlendi.
Diyabetik sıçanlarda uPAR ve vitronektin moleküllerinin endometriyumdaki dağılımlarının incelenmesi
Amaç: Bu çalışmada streptozotosin (STZ) ile diyabet oluşturulan sıçanlarda, implantasyon öncesi proöstrus ve östrus dönemlerinde uterus dokusunda uPAR ile vitronektin moleküllerinin uterus lümen epiteli, bez epiteli ve stromadaki dağılımlarını immunhistokimyasal olarak incelemeyi amaçladık. Ayrıca, diyabette implantasyon öncesi süreçte uterusta meydana gelen histomorfolojik değişiklikleri histokimyasal, ultrastrüktürel yöntemlerle araştırdık. Yöntem: Deneysel modelimizde 28 adet Wistar suşu dişi sıçan kullanıldı. Denekler 4 gruba (n=7) ayrıldı. Deneklere vaginal smear yöntemi uygulanarak siklus tayini yapıldı ve uygun dönemdeki denekler seçilerek sakrifiye edildi. Grup 1 (kontrol grubu); hiç birşey uygulanmadan, siklusun proöstrus safhasında uterus doku örnekleri alınan grup. Grup 2 (kontrol grubu); hiç birşey uygulanmadan, siklusun östrus safhasında uterus doku örnekleri alınan grup. Grup 3 (diyabet grubu); deneklere intraperitonal olarak sodyum sitrat içinde çözünmüş STZ (45 mg/dl) uygulandıktan 8 hafta sonra proöstrus safhasında uterus doku örnekleri alınan grup. Grup 4 (diyabet grubu); deneklere intraperitonal olarak sodyum sitrat içinde çözünmüş STZ (45 mg/dl) uygulandıktan 8 hafta sonra östrus safhasında uterus doku örnekleri alınan grup. Tüm denekler 8 haftalık deney uygulanmasından sonra sakrifiye edildi. Histokimyasal incelemeler için hematoksilen ve eozin (H&E), masson trikrom ve periyodik asit schiff (PAS), immünohistokimyasal olarak da uPAR ve vitronektin antikorları ile boyamalar yapıldı, uterus ince yapısı ultrastrüktürel düzeyde incelendi. Bulgular: Yapılan histokimyasal ve ultrastrüktürel incelemelerde kontrol proöstrus ve östrus gruplarında normal uterus yapısında olduğu gözlendi. Diyabet proöstrus ve östrus gruplarında, uterus lümen çapında daralma, lümen epiteli hücrelerinin boylarında kısalma, bağ dokusunda artış ve ince yapı düzeyinde uterus lümenini döşeyen epitelde ve hücre bağlantılarında yapısal değişiklik bulundu. Yapılan immunohistokimyasal incelemeler sonucu, vitronektin molekülünün diyabet proöstrus grubunda, kontrol grubuna göre tutulumunun azaldığı, diyabet östrus grubunda, kontrol grubuna göre vitronektin molekülünün tutulumunun arttığı gözlenmiştir. uPAR molekülünün ise, diyabet proöstrus grubunda, kontrol grubuna göre tutulumunun arttığı, diyabet östrus grubunda, kontrol grubuna göre yine uPAR molekülünün tutulumunun arttığı gözlenmiştir. Sonuç: Elde ettğimiz verilere dayanarak diyabetin implantasyon öncesi süreçte uterus doku hasarı oluşturduğu ve implantasyon için gerekli olan vitronektin ve uPAR moleküllerinin, uterus dokusundaki dağılımlarını etkilediğini gözlemledik. Anahtar Kelimeler: Diyabet, pröstrus, östrus, uPAR, vitronektin.
Leptin'in sıçanlarda kırık iyileşmesi üzerine histolojik etkileri
Leptin başlıca beyaz yağ dokusu tarafından salgılanan polipeptid yapılı bir hormondur. Vücutta metabolizma hızını, enerji tüketimini düzenlemesinin yanında fertilite, immün fonksiyon, anjiyogenez ve hatta kemik oluşumu üzerine etkilere sahip multifonksiyonel bir hormondur.Bu çalışmada leptinin kırık iyileşmesi üzerine etkileri, rat tibialarında deneysel kırık modeli oluşturularak histolojik ve radyolojik olarak değerlendirilmiştir. Çalışma için, ortalama ağırlıkları 323 gr (295-352 gr) olan, 16 haftalık Spraque Dawley cinsi 54 adet rat kullanıldı. Rastgele seçilerek 3 gruba ayrılan ratların sağ tibialarında anestezi altında kırık oluşturuldu ve internal tespit yerleştirildi. 14 gün boyunca kontrol grubuna 0,5 ml serum fizyolojik, 0,1 leptin grubuna 0,1 µg/kg leptin ve 0,3 leptin grubuna 0,3 µg/kg leptin intraperitoneal olarak verildi. Bu gruplar da kendi aralarında 14., 21. ve 35. günlerde değerlendirilmek üzere 6'şar rattan oluşan 3'er gruba ayrıldı. Bu şekilde 9 grup oluşturuldu. Kontrol, 0,1 leptin ve 0,3 leptin gruplarına ait 6 rattan oluşan birer grup 14. , 21. ve 35. günlerde sakrifiye edilerek sağ tibiaları radyolojik ve histolojik olarak değerlendirildi ve gruplar arası karşılaştırmaları yapıldı.Histolojik değerlendirmede leptinin gerek 21. gündeki gerekse 35. gündeki gruplarda kırık iyileşmesini hızlandırdığını tespit ettik. Radyolojik değerlendirmede ise özellikle 35. gündeki 0,3 leptin grubunun kontrol grubuna göre daha fazla iyileşme gösterdiğini gözlemledik.Sonuç olarak histolojik ve radyolojik değerlendirmelerde intraperitoneal uygulanan leptinin, kırık iyileşmesini dozla ilişkili olarak artırdığı tespit edildi.
Profenofos ve Mcpa'nın testise etkilerinin ultrastrüktürel düzeyde incelenmesi
Endokrin bozucular hormonları taklit ederek veya onları bloke ederek vücuttaki normal işlevleri bozmakta, normal hormon seviyelerini değiştirmekte, hormon üretimini uyarmakta ya da üretimi duraksatmakta ya da hormonların organizmadaki yer değiştirme yollarını bozmaktadır. Endokrin bozuculardan önemli bir grup da pestisitlerdir. Pestisitler içinde en geniş kullanım alanı olan grup organofosfat grubudur. Bu bileşiklerden profenofos ve 4-kloro-2-metil fenoksi asetik asit (MCPA)'in; erkek genital sistemine olumsuz etkilerinin bilinmesine rağmen ultrastrüktürel düzeydeki etkisi hakkındaki çalışmalar sınırlıdır. Bu nedenle bu çalışmada hem MCPA' nın hem de profenofosun; testis seminifer tübülleri üzerine ultrastrüktürel düzeydeki etkisini karşılaştırmalı olarak incelemek amaçlanmıştır. Çalışmada; 14 haftalık sıçanlardan her grupta 10 adet erkek sıçan olacak şekilde 3 grup oluşturulmuştur. Grup1 kontrol grubu, Grup 2 profenofos grubu ve Grup 3 MCPA grubudur. Kontrol grubuna gavaj yoluyla yalnızca distile su uygulanmıştır. Profenofos grubuna haftada 2 kez belirlenen gün ve saatte 17 mg/kg dozunda profenofos gavaj yoluyla 1 ay süre ile uygulanmıştır. MCPA grubuna her gün belirlenen saatte 190 mg/kg dozunda MCPA gavaj yoluyla 1 ay süre ile uygulanmıştır. Çalışmadaki tüm hayvanların sakrifiye edilmesi sonucu çıkarılan testis dokularında elektron mikroskobik inceleme ve biyokimyasal inceleme yapılmıştır. Elektron mikroskobik incelemelere göre, kontrol grubunda spermatogenez süreci sağlıklıdır. Profenofos grubunda spermatogenik hücrelerde ve Sertoli hücrelerinde yapısal bozulmalar izlenmiştir. MCPA uygulanan grupta spermatogenik seriyi oluşturan hücreler arasında boşluklar, hücresel dejenerasyon profenofosa karşın hücrelerde yapısal hasar biraz daha belirgindir. MCPA uygulanan grupta bazı Leydig hücrelerinde apopitozis belirlenmiştir. Biyokimyasal incelemelere göre, serbest ve toplam testosteron ölçümünde profenofos ve MCPA gruplarında, uygulama öncesi ve sonrasında istatistiki olarak anlamlı bir farklılık vardır. Testis görünümünde yapısal düzeyde gördüğümüz dejenerasyon ile biyokimyasal verilerimizin sonucu; profenofos ve MCPA' nın spermatogenez sürecinin sağlıklı olarak devam etmesini engellediğini düşündürmüŞtür.
İnsanda trofoblastların bulundukları mikroçevreye göre karşılaştırmalı incelenmesi: Işık ve elektron mikroskobu düzeylerinde çalışma
Plasenta ve fetal zarların ana bileşeni olan trofoblastların yerleşimlerine bağlı olarak farklı işlevleri yerine getirdikleri ve gelişim sürecinde işlevlerini yansıtan yapısal özellikler kazandıkları iyi bilinmektedir. Bu çalışmanın amacı trofoblast kaynaklı çeşitli yapıların (sinsityotrofoblast, sinsityal düğüm, sinsityal tomurcuk, sinsityal köprü vb.); ekstravillöz trofoblastların (koryon plağı, fibrin içi, desidua, damara invaze olmuş vb.) ve endotel de dahil olmak üzere diğer stromal bileşenlerin ışık ve elektron mikroskop düzeyinde karşılaştırmalı incelenmesiyle işlevlerine yönelik yeni ipuçları elde edilmesi olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada bilinen bir kronik hastalığı olmayan, gebelik veya doğumda herhangi bir komplikasyon gelişmemiş, sezeryan doğum gerçekleşen on adet sağlıklı term gebeden elde edilen plasenta örnekleri kullanılmıştır. Doku örneklerinden hazırlanan dondurulmuş kesitler hematoksilen-eozin, yarı ince kesitler toluidin mavisi ile boyanarak ışık mikroskopta incelenmiştir. İnce kesitler ise uranil asetat-kurşun sitrat ile boyanarak elektron mikroskobunda değerlendirilmiş ve fotoğraflanmıştır. Çalışmamızda villus ağacını oluşturan villus çeşitleri, stromal hücreler, koryon plağı ve desidua olağan görünümünde gözlenmiştir. Sitotrofoblastların çoğalarak sinsityotrofoblasta dönüşümünün term plasentada hala sürdüğüne, matriks tip fibrinoidin fibrin tip fibrinoidden geliştiğine ve trofoblastların hipoksik hücre zedelenmesine cevap olarak buraya göç ettiğine ait belirtiler izlenmiştir. Desidual damarlarda ve desiduaya komşu intervillöz aralığa bakan sinsityal örtüde endotel-sinsityotrofoblast dönüşümünün işaretleri saptanmıştır. Yüzen villuslarda anjiogenezden çok vaskülogenezle yeni damar oluşumunun term plasentada da sürdüğünün izleri belirlenmiştir. Retikulum hücresi, fibroblast, miyofibroblast, perisit gibi stromal hücrelerin ve trofoblastların birbirine çok benzer yapısal özellikler taşıdığı görülmüştür. Bu nedenle; ortak bir kökene sahip olmalarının yanında paylaştıkları ince yapı düzeyindeki benzerliklerden ötürü trofoblastların, stromal hücrelerin ve yeni damar oluşumu sürecinde rol alan endotel hücrelerinin bulundukları özel mikroçevrede uygun koşullarda birbirlerine kolaylıkla dönüşebilen hücreler oldukları düşünülmüştür.
Farelerde erken gebelik boyunca uterusta bazı notch sinyal yolağı üyelerinin ekspresyonu
Memelilerde gebeliğin sağlıklı bir şekilde gerçekleşmesi ve ilerlemesinde birçok faktör rol almaktadır. Fertilizasyondan sonra embriyonun preimplantif dönem gelişimi ve implantasyon ile desidualizasyonun sağlıklı gelişimi, başarılı gebeliğin kurulmasında temel oluşturmaktadır. Bu olaylar heterojen hücre toplulukları içeren uterusta gerçekleşir. Preimplantif gelişimini sağlıklı tamamlayan embriyo, senkronize bir şekilde hazırlanmış ve reseptif hale gelmiş uterusa implante olabilmektedir. Notch sinyali, hücre kaderinin belirlenmesinde ve birçok hücresel mekanizmada rolü olan, evrimsel olarak korunmuş hücreler arası bir sinyal yolağıdır. Notch sinyali doğrudan hücre-hücre temasıyla aktive olur ve embriyonik gelişimde apoptoz, hücre proliferasyonu, farklanma, hücre soyu kararı gibi birçok biyolojik fonksiyonun düzenlenmesinde gereklidir. Erken gebelikte uterus reseptivitesinin ve desidualizasyonun kurulmasında Notch sinyal yolağı üyelerinin etkileri henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Bu nedenle bu çalışmada, farelerde erken gebelik dönemlerinde, aktif Notch1 (NICD1) ve aktif Notch2 (NICD2) ile Notch sinyal yolağı hedef genlerinden olan HEY1 ve HES5'in uterustaki dağılımlarının ve ekspresyon miktarlarının incelemesi amaçlandı. Bu amaçla, östrus fazı, gebeliğin 1., 4., 5. ve 8. günlerinde olan fare uterus dokuları alındı ve immünohistokimyasal gözlemler için %10'luk formalin ile fikse edilerek parafin takibe alındı. Elde edilen parafin bloklardan 5-7 µm kalınlığında alınan kesitlerde, immünohistokimyasal yöntemle NICD1, NICD2, HEY1 ve HES5 proteinlerinin immünolokalizasyonları belirlendi. Western Blot analizleri için, taze uterus dokuları kullanıldı ve bu yöntemle aynı proteinlerin ekspresyon miktarları belirlendi. Elde edilen bulgulara göre; NICD1 immünoboyanması tüm gruplarda doku genelinde eksprese olurken HEY1 ile paralel şekilde gebeliğin 5. gününde artış gösterdiği; NICD2 ve HES5 immünoboyanmasının yoğunluğunun NICD1 ve HEY1'e göre daha az olduğu, NICD2'nin gebeliğin 5. gününde artış göstererek özellikle blastosiste ait olan yapılarda ve PDB'de yoğunlaştığı, 8. günde ise SDB'de çok yoğunlaştığı, ayrıca özellikle gebe olmayan östrus fazındaki fare uterusunda yoğun miktarda bulunan gebeliğin 1, 4 ve 5. günlerinde sayıları gittikçe azalan mast hücrelerinde NICD2 immünoboyanmasının çok yoğun olduğu gözlendi. Sonuç olarak, NICD1, NICD2, HEY1 ya da HES5 aracılı Notch sinyal yolağının fare uterus dokusunun gebelik için hazırlanması, implantasyon olayının gerçekleşmesi, embriyo gelişim sürecinin kontrolü için gerekli olabileceği söylenilebilir.
Hiperglisemik koşullarda ve diyabetik plasentalarda mTOR sinyal yolağının anjiyogenez mekanizmasına etkisi
Plasenta kompleks bir vasküler sisteme sahiptir ve feto-plasental damar sistemi maternal ve fetal düzenlenişlerdeki hatalara oldukça duyarlıdır. Vasküler yapıların gelişimi ve fonksiyonu diyabetik çevreden etkilenmektedir. Anjiyogenez süresinde pek çok kritik basamak, çeşitli moleküller ve sinyal iletim yolakları tarafından düzenlenmektedir. mTOR sinyal iletim yolağının anjiyogenez mekanizmalarında rol oynadığı bilinmektedir. Ancak diyabetik gebeliklerde mTOR yolağının plasental anjiyogenez mekanizmaları üzerindeki etkileri bilinmemektedir. Bu nedenle bu çalışmada, kültür ortamında HUVEC hücrelerine yüksek miktarda glikoz verilerek, hipergliseminin anjiyogenez mekanizmaları üzerine etkisi ve bu etkinin mTOR sinyal iletim yolağına bağlı olup olmadığı değerlendirilmiştir. Elde ettiğimiz verilere göre, hiperglisemik koşullarda VEGF ekspresyonu mRNA düzeyinde, çözünür VEGF ekspresyonu ise protein düzeyinde artmıştır. VEGFR2 hem mRNA hem de protein düzeyinde artış gösterirken VEGFR1 sadece mRNA düzeyinde artmıştır. mTOR'un hedef proteinlerinden biri olan 4EBP1'in fosforilasyonu hiperglisemik koşullarda artmıştır. Akt fosforilasyonu azalmış, p70S6K fosforilasyonu ise değişmemiştir. HIF-1α ekspresyonu ise mRNA düzeyinde artmıştır. Rapamisin ve PP242 inhibisyonu ile hiperglisemik koşullarda artan 4EBP1 ve VEGFR2 ekspresyonu azalmıştır. Matrijel ve yara iyileşme analizi sonuçlarına göre hiperglisemik koşullarda endotel hücre migrasyonunun ve damar tüpü oluşturma kapasitesinin arttığı, mTOR yolağı inhibisyonu ile bu artışın baskılandığı gözlenmiştir. Kız bebeklere ait diyabetik plasentalarda hem plasental ağırlığın, hem de mTOR, 4EBP1, VEGF ve VEGFR2 ekspresyonunun azaldığı, erkek plasentalarda anlamlı bir değişim olmadığı gözlenmiştir. Bu çalışma ile birlikte diyabette bozulan plasental vasküler homeostazda mTOR yolağının rol oynayabileceği ve cinsiyete bağlı olarak farklılıkların gözlenebileceği ilk kez ortaya konmuştur.
Süperovulasyon uygulamasının DNA metiltransferaz genlerinin ekspresyonu üzerine etkisinin araştırılması
Memeli oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde, epigenetik mekanizmalardan birisi olan DNA metilasyonu kritik bir öneme sahiptir. DNA metilasyonu, genomdaki CpG ya da CpG olmayan adacıklardaki sitozin nükleotidlerinin 5. karbon atomuna metil grubu takılmasıyla gerçekleştirilir. De novo(yeni baştan) ve sürdürme metilasyon mekanizmalarında, DNA metiltransferaz (DNMT) enzimleri rol oynar. Yapılan çalışmalarda, oosit ve erken dönem embriyo gelişiminde DNMT enzimlerinden olan DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B'nin önemli görevleri olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada, IVF uygulamaları ve deneysel araştırmalarda sıklıkla kullanılan süperovulasyonun DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B proteinlerinin ekspresyonal düzeyleri ve hücre içi yerleşimleri üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu çalışmada Balb/C ırkı 6 haftalık dişi farelerden kontrol, normal doz [5 IU gebe kısrak serum gonadotrophini (PMSG)ve 5 IU insan korionik gonadotrophini (hCG)] ve yüksek doz (7.5 IU PMSG ve 7.5 IU hCG) olmak üzere 3 grup oluşturuldu. Belirlenen zaman çizelgesinde toplanan oosit [germinal vezikül (GV) ve metafaz II (MII)] ve erken dönem embriyolarda (1-hücreli ve 2-hücreli) DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B'nin ekspresyonal düzeyleri ve hücre içi yerleşimleri immünofloresan tekniği ile belirlendi. Elde edilen boyanmalar, ImageJ yazılımı ile analiz edilerek göreli ekspresyonlar belirlenip; One Way Anova istatistiksel testi ile analiz edildi. Çalışmamızın sonuçlarına göre; DNMT1 ekspresyonu, analiz edilen oosit ve erken dönem embriyolarda nükleer bölgede zayıf, sitoplazmada daha yoğun gözlenirken membrana yakın bölgelerde ise yoğun şiddette olduğu her üç grupta da belirlenmiştir. DNMT3A ve DNMT3B ekspresyonu, nükleer bölgede yoğun iken, sitoplazmik bölgede ise normal şiddette yerleşim göstermiştir. Ayrıca, DNMT1, DNMT3A ve DNMT3B protein ekspresyonları normal ve yüksek doz gruplarından elde edilen GV ve MII oosit, 1-hücreli ve 2- hücreli embriyolarda kontrol grubuyla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gözlenmiştir (P<0.05). Sonuç olarak, bu çalışma ile süperovulasyonun DNMT proteinlerinin ekspresyonal düzeylerini değiştirdiği ilk defa ortaya konulmuştur. Kontrol grubu dişilerden alınan oosit ve embriyolarda bu proteinlerin hücre içi yerleşimleri ilk defa detaylı olarak incelenmiştir. Deneysel çalışmalarda ve yardımcı üreme tekniklerinde sıklıkla kullanılan süperovulasyonun etkisinin oosit ve erken dönem embriyolarda daha detaylı araştırılması gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: DNMT, Embriyo, Oosit, İmmunofloresan, Süperovulasyon
Stz-indüklenmiş diyabetik fare ovaryumunda endoplazmik retikulum stresi (ERS) ilişkili protein ekspresyonlarının değerlendirilmesi
Hücre organellerinden biri olan endoplazmik retikulumun (ER) başlıca görevi; yeni oluşan sekretuvar ve membran proteinlerin olgunlaşmasını ve tersiyer yapılarda doğru katlanmalarını sağlamaktır. N-bağımlı glikozilasyon inhibisyonu, kalsiyum dengesinin bozulması, hipoksi, oksidatif stres, glukoz yoksunluğu, viral enfeksiyonlar ve ortamın sıcaklığı gibi çevresel koşullar, yanlış katlanmış ya da katlanmamış proteinlerin ER lümeninde birikmesine yol açarak ER stresi (ERS) adı verilen olayı meydana getirir. ERS'ye cevap olarak hücrede dengeyi yeniden sağlamak için katlanmamış protein cevabı (Unfolded Protein Response, UPR) adı verilen sinyal yolağı aktif hale gelir. UPR veya ERS cevabının çeşitli fizyolojik durumlara karşı etkili bir adaptasyon mekanizması olduğu bilinmekle birlikte diabetes mellitus gibi hastalıkların fizyopatolojisi ile ilişkisi olduğu bildirilmiştir. Diyabetle indüklenmiş hiperglisemi ya da glukoz emilimindeki yetersizliğin fare granuloza hücrelerinin apoptozuna yol açtığı ve oositlerde; mayozun ilerlemesini azalttığı, düşük oosit kalitesine neden olduğu bilinmektedir. Hiperglisemik koşulların fare ovaryumlarında yarattığı olumsuz sonuçların nedenleri arasında, bozulan protein sentez mekanizması, ERS'nin ve buna cevap olarak ortaya çıkan hücre kaderini belirleyen UPR mekanizmasının rolleri olabilir. Çalışmamızda, 24 günlük toplam 31 adet BalbC ırkı dişi fare kullanılarak üç grup oluşturuldu: 1) kontrol grubu (herhangi bir uygulama yapılmayan grup) (n=10), 2) çözgen grubu (intra peritonel (i.p) 100 µl sodyum sitrat enjekte edilen grup) (n=6), 3) diyabet grubu (n=15) (tek doz 90 mg/kg streptozotosinin (STZ) i.p. olarak enjekte edilen grup). Diyabet modelinin takibi için, STZ enjeksiyonu takiben 2. , 7. ve 14. günlerde kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 300 mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edildi. 14 günlük takip süresinin sonunda dişiler sakrifiye edilerek ovaryum örneklerinde ERS proteinlerinin (GRP78, DDIT3, KASPAZ 12 ve p-PERK) lokalizasyonları ve ekspresyon seviyelerini göstermek amacıyla immünohistokimya ve western blot yöntemleri uygulandı. qRT-PCR yöntemi ile ERS belirteçleri olan Grp78 ve Ddit3 genlerine ait mRNA ekspresyon seviyeleri incelendi. Diyabet grubuna ait ovaryum örneklerinde p-PERK ve DDIT3 proteinlerinin immün boyanmaları kontrol ve çözgen gruplarına kıyasla anlamlı olarak arttığı gözlendi. Her iki proteininde immün boyanmaları özellikle atretik foliküllerde, apoptotik granüloza hücrelerinde ve dejenere ovositlerde görüldü. Ovaryumlarda p-PERK, GRP78 ve Kaspaz 12 protein miktarı açısından gruplar arasında anlamlı farklılık olmadığı belirlendi. Grp78 mRNA düzeyi gruplar arasında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Ddit3'ün mRNA miktarı diyabetik gruplarda anlamlı olarak artarken protein düzeyinde gruplar arası herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. XBP1s protein miktarının ise diyabetik ovaryumlarda arttığı gözlenmiştir. Sonuç olarak; diyabetin fare ovaryumlarında ERS'yi başlatarak UPR'yi tetiklediği tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: ERS, Diyabet, UPR, Fare, Ovaryum.
Plasental kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinin kronik böbrek yetmezliğinde proliferasyon ve apoptoz mekanizmalarına etkisi
Kök hücreler normal gelişimin sürdürülmesinde ve erişkin doku rejenerasyonunda birden çok role sahip olan hücrelerdir. Erişkin kök hücreler, hayat süresi sınırlı olan hücrelerin yenilenmesini böylece organların bütünlüğünün sağlanmasını ve hasara yanıt vererek hasar görmüş dokuların rejenerasyonunu sağlarlar. Erişkin kök hücrelerden biri olan mezenkimal kök hücreler, birden fazla hücre serisine farklılaşabilirler ve kendilerini yenileyebilirler. Osteositlere, kondrositlere ve adipositlere farklılaşabilen hücrelerdir. Bir çok çalışmada plasenta mezenkimal kök hücre (MKH) kaynağı olarak gösterildiği gibi, aynı zamanda göbek kordonu stroması, amniyon sıvısı ve amniyon zarı gibi bileşenler de MKH kaynağı olarak gösterilmektedir. Daha önceki çalışmalarda amniyotik membranın kondrojenik, osteojenik ve adipojenik farklılaşmaya giden mezenkimal kök hücrelerden zengin olduğu gösterilmiştir. Kronik böbrek yetmezliğinin (KBY) özelliği, sağlıklı dokunun erozyonu ve fibrozis nedeniyle zaman içerisinde sürekli olarak böbrek fonksiyonlarının kaybıdır. Daha önceki çalışmalarda, hasarı takiben böbreğin yenilenme kapasitesi, zarar gören tübüler hücrelerin değiştirilmesi olarak gösterilmektedir. MKH'lerin tübüler epitel hücrelerine farklılaştığı, böylece renal yapı ve fonksiyonunun yenilendiği gösterilmiştir. Ayrıca MKH'lerin KBY'de renal fonksiyonu koruduğu ve böbreğe yerleşerek ve büyüme faktörlerini salgılayarak renal hasarı engellediği gösterilmiştir. Aristolohik asit (AA) KBY'ye neden olmaktadır. Morfolojik olarak, AA, tübüler atrofiye sebep olan interstisyal fibrozis ile karakterizedir. Bu çalışmada da sıçanlara AA uygulanarak KBY modeli oluşturulmuştur. Amniyon membranından izole edilen mezenkimal kök hücreler, deney grubundaki her bir sıçana 6x10⁵ hücre olarak kuyruk venlerinden transplante edilmiştir. 30 gün ve 60 gün süren iyileşme dönemi sonunda proliferasyon belirteçleri olan PCNA ve Ki67 proteinlerinin ekspresyonuna bakılmış ve kök hücre gruplarında bu proteinlerin ekspresyonu KBY grubuna göre artış göstermiştir. Ayrıca KBY grubunda kök hücre verilen gruplara göre apoptotik PARP'ın ekspresyonunun arttığı gösterilmiş ve TUNEL yöntemiyle de desteklenmiştir. Bunun yanında yine KBY grubunda hücre siklus inhibitörü proteinlerinden olan p57'nin ekspresyonunun kök hücre ve sham gruplarına göre arttığı da gösterilmiştir. Bu çalışma ile birlikte insan plasentasından elde edilen mezenkimal kök hücrelerin kronik böbrek yetmezliği sonucu oluşan fibrozisin onarılmasında proliferasyon ve apoptoz mekanizmalarında etkili olduğu gösterilmiştir.
Ovaryum kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında folikül kaybı mekanizmalarında rol alan baskılayıcı moleküllerin araştırılması
Doğurganlığı koruma teknikleri, kanser gibi yıkıcı kemoterapi ve radyoterapi uygulamaları içeren hastalıkların tedavisi sonrasında, kısırlık ve hormonal yetmezliklerle başetmede önemli bir seçenektir. Üremeye yardımcı tekniklerin kullanıma sunduğu embriyo, oosit ve ovaryum kriyoprezervasyonu, kadın hastaların ovaryum rezervlerinin ve doğurganlıklarının, bu tedaviler öncesinde korunması için bir kolaylık sağlamaktadır. Ancak, bekâr ve pre-pubertal hastalarda kendisini en fazla kanıtlamış yöntem olan embriyo kriyoprezervasyonu seçeneği uygun değildir. Kanser tanısı sebebiyle bir an önce tedavi planına başlanması gereken hastalar için oosit toplama süreci zaman kaybına neden olmaktadır. Hormon uyarısıyla tümör dokusunu indükleme riskinin olduğu durumlarda (örneğin östrojen reseptörü pozitif olan meme kanseri olguları) ovaryum dokusu kriyoprezervasyonu tek seçenek olarak karşımıza çıkmaktadır ve günümüzde bildirilmiş 60 kadar gebelik olgusu mevcuttur. Primordiyal folikülden primer foliküle geçişte, kontrollü aktive edici ve baskılayıcı rol oynayarak folikül havuzunun korunmasında rol alan sinyal yolakları birbirinden bağımsız ancak dengeli bir şekilde çalışmalıdır. Baskılayıcı ve aktivatör genlerin dengeli çalışmadığı durumlarda, klinikte prematür ovaryan yetmezlik olarak bilinen, foliküllerin kitlesel aktivasyonu ile folikül havuzunun yarısından fazlasının hatta daha büyük kısmının erkenden tükenmesine sebep olmaktadır. Bununla bağlantılı olarak, ovaryum kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında geciken anjiyogenez ve oluşan hipoksi ovaryumda primordiyal folikülden primer foliküle geçişte görev alan intrensek mekanizmaları bozuyor olabilir. Ovaryum doku kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında meydana gelen folikül kaybının nedenleri arasında foliküllerin büyümelerinin baskılanma mekanizmasının bozulmuş olabileceğini araştırdığımız bu çalışmada pTEN, Tsc1, p27 ve AMH moleküllerinin ekspresyonlarını değerlendirdik. Bulgularımız, literatüre benzer şekilde dondurulup çözme ve transplantasyon sonrasında ovaryumda primordiyal folikül havuzunun azaldığını gösterdi. pTEN, Tsc1, p27 ve AMH moleküllerinin ekspresyonlarını değerlendirdiğimizde K grubu ile DÇ grubunda bir fark gözlenmezken, T ve DÇT gruplarında bu moleküllerin pTEN, Tsc1 ve p27 ekspresyonlarının primordiyal foliküllerde, AMH ekspresyonunun ise büyüyen foliküllerde neredeyse tamamen ortadan kalktığı gözlendi. Ovaryum kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında, primordiyal folikülden primer foliküle geçişte rol oynayan baskılayıcı moleküllerin ekspresyonlarını araştırdığımız bu çalışma ile literatürde ilk kez bu konuyu değerlendirmiş oluyoruz. Sonuçlarımız, ovaryum doku kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu sonrasında primordiyal folikül kaybı ile ilişkili sürece yeni bir yaklaşım sunmaktadır ve primordiyal folikülden primer foliküle geçişte fren mekanizmasının adeta bozulduğunu işaret etmektedir. Primordiyal folikülden primer foliküle geçişte rol oynayan aktivatörler ve baskılayıcıların bu süreçte fonksiyonel değerlendirmelerini yaptığımız yeni çalışmalar ovaryum kriyoprezervasyonu ve transplantasyonu ile ilişkili süreçleri daha da aydınlatabilecektir.
Elektromanyetik alana maruz kalan sıçan beyin dokusunda oksidatif stres üzerine karnitinin immunohistokimyasal ve yapısal etkileri
Bu çalışmada Elektromanyetik Alana (EMA) maruz bırakılan sıçanlarda, beyin dokusunda karnitinin yapısal, antiapopitotik ve oksidatif stres üzerine etkilerini incelemek amaçlanmıştır.Çalışmada Wistar cinsi yetişkin erkek sıçanlar (250-300 g) kullanıldı. Çalışma grupları şu şekilde oluşturuldu: I. grup: Sham grubu. EMA'na maruz kalma ve enjeksiyon uygulaması yok (n=10). II. grup: EMA+S grubu. EMA'na maruz kalan ve serum fizyolojik uygulanan sıçanlar (n=10, 1 ml/kg, po, 30 gün). III. grup: EMA+KAR grubu. EMA'na maruz kalma+L-karnitin uygulanan sıçanlar (n=10, 300 mg/kg, po, 30 gün). EMA+S ve EMA+KAR gruplarına 30 gün süreyle 50 Hz, 3 mT, 4 saat/gün EMA uygulandı Sham grubuna EMA veya ilaç uygulanmadı. Deney sonunda oksidatif stres parametrelerinden lipid peroksidasyon ürünleri (malondialdehit; MDA), antioksidan enzimlerden süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GPx), apopitozu göstermek için TUNEL ve aktive antikaspaz-3 immunohistokimyasal incelemeler yapıldı. Gruplar arasındaki farklar one-way ANOVA posthoc Bonferroni testi ile değerlendirildi. P< 0.05 anlamlılık düzeyi esas alındı.EMA+S grubunda MDA değerleri, prefrontal korteks, striatum ve hipokampus bölgelerinde sham ve EMA+KAR gruplarına göre anlamlı olarak yüksek bulundu. SOD ve GPx enzim aktiviteleri her üç beyin bölgesinde, sham ve EMA+KAR gruplarında EMA+S grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulundu. EMA+S grubunda apopitotik hücre yoğunluğu sham ve EMA+KAR gruplarına göre yüksek olarak bulundu. Sham ve EMA+KAR gruplarının sonuçları benzerlik göstermekteydi.Sonuç olarak bu çalışmada beynin farklı bölgelerinde EMA'nın neden olduğu hasarlara karşı karnitinin koruyucu etkisi ilk kez gösterilmiştir. Karnitin antioksidatif etkisi aracılığıyla antiapopitotik etki gösterebilmektedir.Anahtar kelimeler: Elektromanyetik alan, beyin, oksidatif stres, apopitozis, karnitin
Trifluralinin sıçan karaciğer ve duodenumu üzerine etkisinin biyokimyasal ve histolojik incelenmesi
Çalışmamızda tarım alanlarında yoğun bir şekilde kullanılan dinitroanniline türevi bir herbisit, Trifluralin'in (TRF) karaciğer ve duodenum üzerine olası toksik etkileri histolojik ve biyokimyasal olarak incelendi.Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Etik Kurulu'nun 21.11.2008 gün ve 128 sayılı kararı ile çalışmaya başlandı.Araştırmamızda yaklaşık 200-250 gr ağırlığında 30 adet Wistar suşu erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar her grupta 7 hayvan olacak şekilde 4 gruba ayrıldı. Birinci grup herhangi bir şey uygulanmamış Kontrol grubu. İkinci grup mısır yağı verilen Sham grubu. Üçüncü grup 2 g/kg/gün TRF+mısır yağı verilen Yüksek Doz(YD) grubu. Dördüncü grup 0.8 g/kg/gün TRF+mısır yağı verilen Düşük Doz (DD) grubu. Uygulanan maddeler 21 gün süreyle intragastrik gavaj yoluyla verildi. Deney sonunda sıçanlar sakrifiye edildi. Deneklerin karaciğer ve duodenumları rutin histolojik doku takibinden sonra immunhistokimya TUNNEL pozitif hücre sayımı ve H&E ile boyanarak histolojik değerlendirme ve morfometrik ölçümler yapıldı. Diğer kısım doku örnekleri ise MDA, GPx ve SOD değerlendirmeleri için ayrıldı. Deney sonu alınmış olan kan örnekleriylede, AST, ALT, ALP ve Albumin seviyeleri değerlendirildi. Ayrıca sıçanların deney başında ve deney sonundaki vücut ağırlıkları da ölçülüp değerlendirildi.Histolojik ve morfometrik değerlendirmeye göre, TRF uygulanmış YD ve DD gruplarının, kontrol ve sham gruplarına göre karaciğer ve duodenum dokularında hasarın olduğu, Tunel pozitif hücrelerin YD ve DD gruplarında Kontrol ve Sham gruplarına göre fazla sayıda olduğu gözlendi. Gruplar arası MDA, SOD ve GPx değerleri kıyaslandığında karaciğer dokusunda YD ve DD grubunda Kontrol ve Sham grubuna oranla MDA düzeyinin artığı ve GPx düzeyinin ise azaldığı gözlenirken SOD değeri sadece YD grubunda anlamlı düzeyde azalma göstermiştir. Duodenum dokusunda MDA ve SOD değerleri YD grubunda anlamlı düzeyde değişiklik gösterirken diğer gruplarda farklılığa rastlanmamıştır. Ancak GPx düzeyleri değerlendirildiğinde gruplar arası bulunan fark istatistiksel olarak anlamlı değildir.Elde ettiğimiz bulgular doğrultusunda TRF' nin karaciğer ve duodenum dokularında oksidatif stresi arttırdığı, histolojik hasar oluşturduğu ve biyokimyasal değişikliklere neden olduğunu düşünmekteyiz.Anahtar kelimeler: Trifluralin, Karaciğer, Duodenum, Apopitoz, Oksidatif stres
Metil parationun testiste oluşturduğu toksik hasara likopenin koruyucu etkisinin biyokimyasal, ışık mikroskobik ve ultrastrüktürel düzeyde incelenmesi
Çalışmamızda organofosfatlı bir insektisit olan Metil paration (MP)'un oluşturmuş olduğu hasara karşı yüksek kapasitede antioksidan etkiye sahip bir karotenoid olan Likopen (LKP)'in koruyucu etkisi, ışık mikroskobik, immunuhistokimyasal, biyokimyasal ve ultrastrüktürel parametreler doğrultusunda araştırılmıştır.Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Etik Kurulu'nun 72/2008 protokol no'lu 08.08.2008 gün ve 90 sayılı kararı ile çalışmaya başlanmıştır.Çalışma gruplarımız; I. grup; Kontrol grubu: Ab libutum beslenen hiçbir madde uygulanmamış bazal değerler için kullanılan deney grubu (n=7, 28 gün) II. grup; Sham grubu: MP eklenmemiş 0,5 ml mısır yağı verilen grup (n=7, 28 gün oral gavaj (og.) III. grup; LKP grubu: (4 mg/kg/gün) LKP 0,5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek verilen grup (n=7, 28 gün og.) IV. MP deney grubu: 0,28mg/kg/gün (1/50 LD50) MP 0.5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek verilen grup (n=7, 28 gün og.) V. grup; MP+LKP deney grubu: 0,28mg/kg/gün MP 0,5 ml mısır yağı içinde çözdürülerek (4 mg/kg/gün) LKP ile birlikte verilen grup (n=7, 28 gün og.) olmak üzere 5 gruba ayrıldı.Bütün gruplardaki deneklerin sağ testisleri MDA, GPx, SOD ve elektronmikroskop (EM) ölçümleri için ayrıldı. MDA, SOD, GPx ölçümleri için ayrılan dokular spektrofotometrik yöntemle incelendi. EM için ayrılan dokular transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile ince yapı düzeyindeki değişiklikleri incelendi. Sol testis ışık mikroskobik incelemeler için ayrıldı. Histolojik takipten sonra TUNEL yöntemi uygulanarak DNA fragmantasyonu değerlendirildi ve aktif kaspaz-3 immunohistokimyasal (IHC) boyama yapılarak TUNEL değerlendirmeleri desteklendi. Hematoksilen-eozin (H&E) ile boyanarak histolojik değerlendirme ve morfometrik ölçümler yapıldı.Testiste yapılan histolojik ve morfometrik değerlendirmeye göre, MP grubunun kontrol, sham ve LKP gruplarına göre hasarlı olduğu ve MP+LKP grubunda LKP'nin bu hasarı önlediği gözlendi. DNA hasarının değerlendirilmesinde kontrol, sham, LKP ve MP+LKP grupları arasında spermatogoniyum ve spermatositlerde TUNEL pozitif boyanan hücrelerde anlamlı fark gözlenmezken, MP grubunda spermatogoniyum ve spermatositlerde TUNEL pozitif boyanan hücreler kontrol, sham ve LKP gruplarına göre anlamlı derecede yüksek bulundu. MP ve MP+LKP grupları karşılaştırıldığında MP+LKP grubunda TUNEL pozitif boyanan hücrelerin sayısında MP grubuna göre anlamlı derecede azalma gözlendi. TUNEL sonuçlarını desteklemek amacı ile yaptığımız aktif kaspaz immunohistokimyasal (IHC) değerlendirmelerine göre; kontrol, sham, LKP ve MP+LKP grupları arasında spermatogoniyum ve spermatositlerde aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücrelerde anlamlı fark gözlenmezken, MP grubunda spermatogoniyum ve spermatositlerde aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücreler kontrol, sham ve LKP gruplarına göre anlamlı derecede yüksek bulundu. MP ve MP+LKP grupları karşılaştırıldığında MP+LKP grubunda aktif kaspaz IHC pozitif boyanan hücrelerin sayısında MP grubuna göre anlamlı derecede azalma gözlendi.Gruplar arası MDA, SOD ve GPx değerleri kıyaslandığında MP grubunda kontrol, sham ve LKP grublarına oranla MDA düzeyinin artığı ve GPX düzeyinin anlamlı derecede azaldığı gözlenirken SOD değerleri istatistiksel olararak anlamlı olmayan bir azalma göstermiştir. MP gurubu MP+LKP grubu ile karşılaştırıldığında MDA düzeyinin anlamlı derecede arttığı GPx düzeylerinin anlamlı derecede azaldığı, SOD değerlerinde ise anlamlı olmayan bir artış gözlenmiştir. Ayrıca deneklerin deney başında ve deney sonundaki vücut ağırlıkları ölçülerek değerlendirmeye alınmıştır.Elde ettiğimiz bulgular doğrultusunda düşük doz MP 'un testiste oluşturduğu toksik hasara 4mg/kg LKP'nin koruyucu etkisi olduğu fakat hasarı tamamen engellemediğini gördük.Anahtar kelime: Metil paration, testis, organofosfat, likopen, apopitoz, ultrastrüktürel
Sıçan serviksinin olgunlaşmasında indüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz'ın (iNOS) önemi ve olası rolü
Servikal olgunlaşma lökosit infiltrasyonu, ESM'nin su içeriğindeki değişiklikler ve kollajen liflerin yeniden düzenlenmesi dahil inflamatuvar bir reaksiyondur. Bu olayın kontrolü, birçok mediyatörün görev aldığına işaret edilmesine rağmen hala büyük oranda bilinmemektedir. İnflamatuvar bir mediyatör olan NO'nun başka dokularda MMP aktivitesini stimüle ettiği ve proteoglikan sentezini baskıladığı bilindiğinden, bu çalışmada NO'nun gebelik süresinde ve doğumda serviksin yeniden yapılanmasında görev alıp almadığı ışık mikroskopu ile immünohistokimyasal olarak ve TEM düzeyinde belirlenmeye çalışıldı. Bu amaçla daha önce deneye girmemiş 200-250 g arasında 108 adet dişi Wistar sıçan kullanıldı. İki dişiye bir erkek olacak şekilde kafeste bir gece bırakılan dişi sıçanlara vajinal simir yapılarak spermiyum gözlenen dişiler gebeliğin 0. günüde kabul edildi. Östrus ve gebeliğin 18, 20, 21., doğum sonrası 0. günler olmak üzere 5 kontrol, gebeliğin 18, 20, 21., doğum sonrası 0. günler olmak üzere 4 deney grubu oluşturuldu. Deney hayvanlarına sabahları 5 gün süreyle oral yolla 50 mg/gün/sıçan L-NAME verildi. Kontrol ve deney hayvanları belirtilen günün sabahında eter anestezisi altında diseke edildi ve ışık ve tranmisyon elektron mikroskopu için ayrıca nitrit/nitrat ölçümlerinde kullanılmak üzere servikal doku örnekleri alındı. Toplanan örneklerden bir kısmı rutin histolojik ve elektron mikroskop takip işlemlerinden geçirildi. Parafin bloklardan alınan kesitlerde iNOS'un dağılımlarına, keza CD45 immünboyanması ile de genel lökosit yoğunluğuna, TEM için alınan ince kesitlerde hücresel ve lifsel elemanların yapısal değişikliklerine bakıldı. L-NAME uygulanan hayvanların servikal dokularında gebelik boyunca ve PPO. günde kollajen lif düzeninde bozulmalar gözlendi. iNOS boyanması kontrole göre daha azdı, nitrit/nitrat değerleri de oldukça düşüktü. CD45 pozitif boyanmış lökosit sayısında, görünüşte östrusa göre kontrol ve deney grubunun gebelik devresinde ve PPO. günlerde artış vardı.Sonuç olarak; 1) L-NAME uygulanan deney grubunda iNOS boyanma şiddeti ile nitrit/nitrat değerlerinin gebelik devresinde kontrole göre önemlilik düzeyinde düşük olmasından NOS ürünü olan NO'nun sıçan serviksinin olgunlaşma ve doğum olayına katıldığını, 2) L-NAME uygulanmasının doğumla sonuçlanmasından NO'nun yalnız olmadığı başka mediyatörlerin de bu olayda görev aldığını, 3) CD45 pozitif lökosit sayısı iki grupta da görünüşe göre artış gösterdiğinden servikal olgunlaşma ve doğum olayının inflamatuvar bir olay olduğunu ifade edebiliriz.
Pro-inflamatuvar sitokin makrofaj migrasyonunu engelleyici faktör (MIF)'ün ilişkide olduğu proteinlerin tanımlanması ve bunların moleküler özelliklerinin belirlenmesi
Makrofaj göçünü (migrasyonunu) engelleyici faktör (MIF) birçok hücre tipi tarafından sentezlenen ve ismi insan monositlerinin göçünü engellemesi nedeniyle verilmiş olan bir immun mediatördür. Son yıllarda, MIF'in Jab1/CSN5 (c-Jun-aktive edici domain-bağlayıcı protein 1)'e bağlanarak, COP9 (constitutive photomorphogenesis: sürekli ışıkla değişim 9) signalozomun (CSN) denedilaz (Cullin proteininden Nedd8 proteinin uzaklaştırılması) aktivitesini durdurduğu ortaya konulmuştur. CSN'nin hedef proteinlerinden biri Cullin'dir ve Cullin proteini SCF (Skp1-Cullin-F box) E3 übikütin ligaz ailesine aittir. SCF E3 übikütin ligazlar, 26S protazomda yıkıma uğratılan substratların übikütinlenmesinden sorumludurlar. Bu nedenle, übikütinlenmeden sorumlu enzimler ve protazom, übikütin protazom sistemi (UPS)'ne ait önemli iki elemandır. MIF'in UPS'deki biyolojik rolünü daha iyi anlamak amacıyla, bu çalışmada MIF'i sürekli olarak ekspre eden NIH3T3 (fare fibroblast hücre dizisi) hücrelerinde biyotinlenmiş MIF ile ilişkide olan proteinleri araştırdıkBiyotinlenmiş MIF ve onun ilişkide olduğu proteinler, streptavidin ile saflaştırıldı. MIF'e bağlanan proteinlerin kütle spektrometrisi ile tanımlanması sonucu, MIF ile birlikte peroksiredoksin 1 ve RP S19 (ribozomal protein S19) gibi MIF'e bağlandığı bilinen proteinlerin de belirlenmesi kullandığımız metodun güvenilirliğini gösterdi. Belirlenen yeni proteinler yanında Valosin-içeren protein (valosin-containing protein, VCP) gibi endoplasmik retikulum (ER)'la ilişkili ve UPS'de çalışan proteinler de saptandı. Belirlenen proteinlerin büyük bir çoğunluğunun UPS'de görevli olduğunun bulunması, bundan sonraki araştırmaların MIF ile VCP arasındaki ilişki üzerine yoğunlaşmasına neden oldu. MIF'in VCP'ye Jab1/CSN5 aracılı bağlandığı, VCP ve Jab1/CSN5 arasındaki bağlanmanın ise direk olduğu protein-protein bağlanmasını belirlemede kullanılan birlikte immun çökeltme (ko-immunopresipitasyon), in vitro çökeltme (in vitro presipitasyon) ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) yöntemleriyle kanıtlandıVCP ve Jab1/CSN5 arasındaki bağlanma, her iki proteine ait mutant ve vahşi tip proteinlerin hücreye transfeksiyonu ve sonra da onların immun çökertmeleri ile belirlendi. Jab1/CSN5'in MPN (Mpr1 Pad1-N-terminal) domainin, VCP'nin ND1 domaini ile bağlandığı belirlendi. Ayrıca, bağlanmanın izopeptidaz aktivitesine sahip MPN domainindeki JAMM (Jab1/MPN domain-associated metalloisopeptidase: Jab1/MPN domain-ilişkili metaloizopeptidaz) motifine bağlı olmadığı da gösterildiJel filtrasyon kromatografisi kullanılarak da, VCP'nin sadece Jab1/CSN5'a değil de tüm CSN kompleksine bağlandığı ortaya konulduRNA interferans aracılı gen susturma (nakdavn: gen ekspresyonunun azaltılması) çalışmaları ile, Jab1/CSN5'ın JAMM motifinin, CSN kompleksi subunitelerinin ve CSN'e bağlı deübikütinlaz USP15 (ubikütin spesifik proteaz 15)'in VCP'ye bağlı substratların deübikütinlenmesi (übikütin zincirlerinin uzaklaştırılması) için gerekli oldukları gösterildiKısacası, bu sonuçlar, VCP'nin CSN ile birlikte bir kompleks oluşturduğunu ortaya çıkardı. Bu kompleksin görevi ise, übikütinlenmiş ve yanlış katlanma gösteren proteinlerin kaderlerini belirlemede görev yaparak, bu proteinleri bağlı bulundukları komplekslerden uzaklaştırmaktır. CSN'e, Jab1/CSN5 aracılı bağlanan MIF ise, Jab1/CSN5 aktivitesini baskılayarak, VCP-CSN kompleksinin görevini engellemektedir.
Varikosel ile indüklenen testiküler hasarın oluşumunda poli ADP-riboz polimeraz (PARP) yolağının rolü
Varikosel erkek infertilitesinin en önemli sebebi olarak gösterilmektedir, ancak testiküler disfonksiyonu ve infertiliteyi indükleyen varikoselin patogenetik mekanizması henüz anlaşılamamıştır. Erkek infertilitesinde oksidatif stresin rolünü değerlendiren son çalışmalar, varikoselli hastalardaki sperm disfonksiyonunun oksidatif stresle ilişkili olduğunu göstermektedir. Poli ADP-ribozilasyon, Poli ADP-riboz Polimerazlar (PARP) tarafından katalizlenen ve DNA zincir kırıklarına verilen hızlı bir hücresel cevaptır. PARP-1, PARP ailesinin en aktif ve en iyi tanımlanmış üyesidir. Oksidatif stres ya da inflamasyon gibi çeşitli patolojik durumlarda aşırı PARP aktivasyonu ortaya çıkmaktadır. PARP'ın aşırı aktivasyonu hücre ölümüyle (apoptoz ya da nekroz) sonuçlanır. Varikosel hakkında birçok çalışma yapılmışsa da, şimdiye kadar hiçbir medikal tedavi varikoselin tedavisinde yeterli başarıyı gösterememiştir. Oksidatif stresin arttığı durumlarda, PARP'ın aşırı aktive olduğu bilindiğinden; bu çalışmada "varikoselli hastalarda testiküler hasarın ve sperm disfonksiyonunun PARP yolağının aşırı aktivasyonuyla ilişkili olabileceği" hipotezi irdelenmiştir. Yedi haftalık yetişkin Rattus norvegicus (Wistar) ırkı erkek sıçanlar rastgele olarak 3 gruba ayrılmıştır. 1.Grup sıçanların (13 haftalık, n=10) sol testislerinde deneysel varikosel modeli ve 2.Grup sıçanlarda sham operasyonu (n=10) gerçekleştirilmiştir. 3.Grup sıçanlar ise kontrol grubunu oluşturmuştur (n=10). Deneysel varikosel modelinin indüklenmesinden sonra tüm gruplardaki sıçanlar sakrifiye edilmiştir. Sol testis dokularında; 4-HNE, PARP-1 ve PAR proteinlerinin immünohistokimyasal ve western blot analizleri ile apoptozun belirlenmesi için TUNEL analizleri gerçekleştirilmiştir. Varikosel oluşturulan testislerin ağırlıkları belirgin olarak azalmış ve bu testislerde seminifer tübül hasarı belirgin olarak artmıştır. Western blot analizleri oksidatif stres artışını ortaya koymuştur. Immünohistokimyasal ve western blot analizleri sonucunda; PAR ve PARP-1'in kontrol ve sham gruplarında ekspre olduğu, ancak varikosel gruplarındaki ekspresyon düzeylerinin tüm germ hücrelerinde anlamlı bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Tüm bunlara ek olarak, varikoselli testislerde apoptotik germ hücre sayısı belirgin olarak artmıştır.Sonuç olarak, varikosel nedeniyle testiste artan oksidatif stres sonucunda PARP yolağının aktive olduğu ve germ hücre apoptozunu indüklediği ilk defa ortaya konmuştur. Genellikle varikoselli bireyin ürettiği sperm hücrelerini değerlendiren literatürdeki çalışmalarla karşılaştırıldığında, üretilen anormal gametlerin oluşumunda PARP yolağının testisteki rolünü değerlendiren bu çalışma, varikosel mekanizmasına moleküler düzeyde önemli bir katkı sağlamaktadır. Bütün bunlarla ilişkili olarak; deneysel varikosel modellerinde farmakolojik PARP inhibitörleri kullanarak, varikosel patogenezinin PARP yolağı ile ilişkisinin değerlendirileceği çalışmaların planlanmasına hızla devam etmekteyiz.
Diyabetik ve büyüme geriliği oluşturulmuş sıçan plasentalarının gelişiminde Akt ve ERK1/2 proteinlerinin rollerinin immünohistokimya ve Western Blot metodlarıyla belirlenmesi
Plasenta maternal metabolizmada meydana gelen değişiklerden etkilenmekte ve fetüsün yaşama şansını arttırabilmek için bu değişikliklere yanıt vermektedir. Aşırı glikoz ve glukokortikoide maruz kalma çeşitli plasental ve fetal patolojilere yol açmaktadır.Hücre içi sinyal iletim yolaklarında görev alan Akt ve ERK1/2 proteinleri plasental gelişimde önem taşımaktadır. Ancak diyabet ve IUGR (uterus içi büyüme geriliği) görülen plasentalarda Akt ve ERK1/2 proteinlerinin hücresel lokalizasyonları ve fosforilasyonlarının plasental gelişim üzerindeki etkilerine dair bilgiler sınırlıdır. Bu nedenle bu çalışmada diyabet ve IUGR görülen plasentalarda Akt ve ERK1/2 proteinlerinin ve bu proteinlerin fosforile formlarının hücresel dağılımları ve protein miktarları immünohistokimya ve Western Blot metodlarıyla incelendi.Çalışmada IUGR grubunu oluşturacak olan gebe dişilere, gebeliğin 10. ve 12. günlerinde deksametazon enjeksiyonuna başlandı. 10. günde enjeksiyona başlanan grup 12. günde sakrifiye edildi. Enjeksiyona 12. günde başlanan gruplar 14, 16, 18 ve 20. günlerde sakrifiye edildiler. Enjeksiyonun yapıldığı ilk gün 100 µg/kg olacak şekilde boyun bölgesinden subkutan olarak deksametazon enjekte edildi. Sonraki günlerde 200µg/kg olacak şekilde deksametazon verilmeye devam edildi. Kontrol gruplarına aynı miktarlarda serum fizyolojik enjekte edildi. Diyabet grubunu oluşturacak olan gebe dişiler, diyabet oluşturabilmek için sakrifiye edilecekleri tarihten yedi gün önce intraperitonel olarak tek doz 40mg/kg streptozotosin (STZ) enjeksiyonuna maruz bırakıldılar. 48 saat sonra kan şekerleri ölçüldü. Kan şekeri değeri 200mg/dl'nin üzerinde çıkan dişiler diyabetik kabul edilerek deneye dahil edildiler. Kontrol gruplarına, aynı miktarda serum fizyolojik enjekte edildi. Toplanan plasenta örnekleri immünohistokimya ve Western Blot yöntemleriyle incelendi.Akt fosforilasyonunun kontrol grubuna kıyasla, IUGR (14. gün hariç) ve diyabet (12. gün hariç) gruplarında anlamlı olarak azaldığı gözlendi. İmmün boyanmalar özellikle bağlantı zonu hücrelerinde belirgindi. IUGR ve diyabet gruplarında immün boyanmalarda azalmalar gözlendi. ERK1/2 fosforilasyonunun IUGR grubunda gebeliğin 12 ve 16. gününde arttığı diğer günlerde ise azalma olduğu tespit edildi. Bu farklar 16 ve 18. günlerde anlamlı idi. Diyabet gruplarında 12. gün hariç diğer günlerde ERK1/2 fosforilasyonunun azaldığı belirlendi. Bu azalma 14 ve 16. günlerde anlamlı idi. ERK1/2 fosforilasyonu tüm gruplarda gebeliğin ortalarına doğru azalış, 18. günde itibaren tekrar artış gösterdi. Fosfo-ERK1/2 immün boyanmaları bağlantı zonu hücrelerininin yanı sıra labirint zon hücrelerinde de belirgin olarak mevcuttu.Sonuç olarak sıçan plasentalarında IUGR ve diyabet etkisi ile Akt ve ERK1/2 proteinlerinin aktivasyonlarının azaldığı dolayısıyla hiperglisemi ve aşırı maternal deksametazona maruziyette bu iki sinyal iletim yolağının etkilendiği tespit edilmiştir. IUGR plasentalarında görülen ağırlık azalmaları ile diyabetik plasenta ağırlıklarında gebeliğin ortalarına doğru azalma, 18. günden itibaren artma gözlenmesinde Akt ve ERK1/2 proteinlerinin dolayısıyla PI3K-Akt ve MAPK-ERK1/2 yolaklarının rol oynadığı söylenilebilir.
Serebral kavernoz malformasyon oluşumunda PDCD10 geninin rolü
Serebral kavernoz malformasyonlar (SKM), merkezi sinir sisteminde görülen normal beyin parankiması olmaksızın endotelyum ile kaplı vasküler kanallardan meydana gelen, vasküler malformasyonlardan biridir. Şimdiye kadar, SKM'larda üç CCM lokusu tanımlanmıştır; bunlar CCM1, CCM2 ve CCM3 olarak adlandırılmıştır. Programlı hücre ölüm geni olarak bilinen PDCD10 genindeki mutasyonlar, otozomal dominant olan serebral kavernoz malformasyon 3 (CCM3)'e sebep olmaktadır. Hastalığın patogenezinde bu genin fonksiyonu hakkında çok az bilgiye sahip olmamıza rağmen son yıllarda CCM3 olarak bilinen PDCD10'un, MSS'nin vasküler modellenmesinde apoptotik etkiyi arttırdığı hipotezi yaygındır. Bizde, bu hipotezi test etmek amacıyla, CCM3'e has poliklonal antikorlar kullanarak insan serebral ve ekstraserebral organlarında CCM3 ekspresyonunu immunohistokimya metodunu kullanarak belirlemeye çalıştık. Ayrıca, CCM3 ekspresyonu immunofloresan metodu kullanılarak farelerde de değerlendirildi. Sonrasında, CCM3 ekspresyonunu mRNA düzeyinde de değerlendirmek için prenatal ve postnatal günlerde fare beyinlerine in situ hibridizasyon metodu uygulandıBu çalışma CCM3 ekspresyonunun sinir sisteminde ve çeşitli ekstraserebral organların arteriyel vasküler endotelyumunda bulunduğunu göstermektedir. Sonuçlar, CCM1 ve CCM2 için daha önce bulunan bulgular ile paralellik göstermekteydi ve buna göre, CCM3/PDCD10 proteini yoğun olarak arteriyel endotelyumda ekspre olurken venöz endotelyumda nadir olarak zayıf bir reaksiyona rastlanmaktaydı. Bulgularımız, PDCD10/CCM3'ün beyin dahil birçok organda nörovasküler ve vasküler yapılarda özellikle arteriyel endotelyumda bulunan bir protein olduğunu göstermektedir.Fetal döneme ait fare beyinlerinde CCM3 mRNA'sı ventriküler, subventriküler ve ara zonlarda, kortikal plakda ve gelişen septum, striatum, orta beyin, pons, serebellum ve medullada görüldü. Postnatal dönemde ise, CCM3/PDCD10 ekspresyonunu koku soğanı, neokorteks, striatum, septal nukleuslar, hipokampus, dentat gyrus, talamik ve hipotalamik çekirdekler, inferior kollikulus, purkinje hücreleri, granüler hücre tabakası ve serebellumun derin nukleusları ile medullanın birçok nukleusunda gözlemledik.Genin apoptotik etkisini araştırabilmek amacıyla genin klonlandığı hücre hatlarında TUNEL ekspresyonunun arttığı gözlendi. Sonucu doğrulamak için yapılan DAPI işaretlemesi de hücrelerde apoptoz oranının artmış olduğunu göstermekteydi.Bulgularımız literatür bilgileriyle değerlendirildiğinde, CCM3'ün apoptozu ve hücre migrasyonunu uyararak, fetal ve postnatal hayat boyunca endotelyal hücre davranışlarını yönlendirdiği, CCM1 ve CCM2 ile birlikte öncelikle nörovasküler anjiyogenez olmak üzere ekstraserebral alanlarda vasküler yapı ve fonksiyonların düzenlenmesinde önemli roller oynadığı söylenebilir.Anahtar Kelimeler: PDCD10, serebral kavernoz malformasyon, apoptoz, nörovasküler birim.
Arsenik toksisitesinin testiste oluşturduğu hasara karşı resveratrolün koruyucu etkilerinin incelenmesi
AMAÇBu çalışmada arseniğin toksik etkilerine karşı sıçanlarda testis dokusunda resveratrolün yapısal, antiapopitotik ve oksidatif stres üzerine etkilerini incelemek amaçlanmıştır.YÖNTEMÇalışmada Wistar cinsi yetişkin erkek sıçanlar (200-300gr) kullanıldı. Sıçanlar 5 gruba ayrıldı: I. grup: Kontrol grubu. Arseniğe maruz kalmamış normal ad libitum beslenen grup (n=7). II. grup : Alkol grubu. Resveratrol alkol ile çözüleceğinden alkolün etkilerini görmek için oluşturulan grup (n=7). III. grup: Arsenik grubu. Oral gavage ile günlük 5mg/kg arsenik verilen grup (n=7). IV. grup : Arsenik + Resveratrol grubu. Oral gavage ile günlük 5mg/kg arsenik verilen ve oral gavage ile günlük 10 mg/kg Resveratrol ile tedavi edilen grup (n=7). V. grup: Arsenik + Resveratrol grubu. Oral gavage ile günlük 5mg/kg arsenik verilen ve oral gavage ile günlük 20 mg/kg Resveratrol ile tedavi edilen grup (n=7). Tüm gruplar için deney süresi 28 gün olarak belirlendi. Deney sonunda biyokimyasal olarak malondialdehit (MDA), glutatyon (GSH) ve apopitozu göstermek için TUNEL ve Caspase 3 yöntemi kullanıldı. Yapısal değişiklikler için ışık mikroskobik ve elektron mikroskobik incelemeler yapıldı. Gruplar arasındaki farklar one-way ANOVA posthoc LSD testi ile gösterildi. p< 0.05 anlamlılık düzeyi esas alındı.BULGULARKontrol grubuna göre arsenik grubu MDA değerleri anlamlı olarak yüksek bulundu. GSH değerleri arsenik grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak düşük bulundu. Işık mikroskobik ve elektron mikroskobik olarak yapılan incelemelerde arsenik grubu seminifer tübüllerinde vakuolizasyon, atrofi, germ hücre dejenerasyonu, tübül lümeninde debris gözlendi. Yapılan immünohistokimyasal incelemeler sonucu arsenik grubu seminifer tübüllerinde kontrol grubuna oranla TUNEL(+) hücre sayısının ve Caspase 3 immunoreaktivite gösteren hücre sayısının arttığı, resveratrol ile tedavi edilen gruplarda ise sayının azaldığı gözlendi.SONUÇSonuç olarak bu çalışmada arseniğin toksik etkilerine karşı testis dokusu üzerinde resveratrolün koruyucu etkisi ilk kez gösterilmiştir. Resveratrol, antioksidatif etkisi aracılığıyla antiapopitotik etki gösterebilmektedir.Anahtar kelimeler: Arsenik, testis, resveratrol, apopitoz, oksidatif stres
Hofbauer hücrelerinin plasental damarlanmadaki muhtemel rollerinin araştırılması
İnsan plasental villus stroması, birçok işlemde rol aldığı düşünülen ve Hofbauer hücreleri (HH) adı verilen makrofajlar içerir. Her ne kadar plasental vaskülogenez ve anjiyogenez üzerine çok sayıda çalışma bulunsa da, HH'lerinin bu işlemlerdeki rolleri hakkında yeterli bilgi yoktur. Bundan dolayı çalışmamızda HH'lerin plasental vaskülogenez ve anjiyogenezde önemli roller oynadıkları hipotezini kurduk ve HH'lerin damarlanmadaki potansiyel rollerini tanısal ve fonksiyonel deneylerle belirlemeyi amaçladık.Çalışmamızda, insan normal erken gebeliklerden elde edilen plasenta dokuları, ışık ve elektron mikroskopi (TEM) araştırmaları ve in vitro çalışmalar için hazırlandı. Plasenta kesitlerine VEGF, Flt-1, Flk-1, Ang-1, Ang-2, Tie-1, Tie-2 ve Netrin-1 için immünohistokimya teknikleri uygulandı. HH'ler ve damar yapılarının sayıları ve yerleşimleri CD68 (Hofbauer hücre belirteci) ve CD31 (endotel hücre belirteci) ile çiftli boyanmış kesitlerde ışık ve konfokal mikroskopları aracılığıyla belirlendi. HH'lerin ince yapı özellikleri ve tipleri TEM ile incelendi.Taze plasental dokulardan izole edilen HH'ler CD68 ve CD14 immünositokimyası ve TEM ile karakterize edildi. İzole edilen HH'ler kültüre edildi ve yönlendirilmiş besiyeri toplanarak anjiyogenik faktörler için ELISA ile test edildi. Ayrıca, anjiyogenez testi için HUVEC hücreleri, HH'lerden toplanan yönlendirilmiş besiyeri ile kültüre edildi.Çalışmamızın sonuçlarına göre HH'lerin büyük çoğunluğu ya anjiyogenik hücre kordonları ve ilkel damar tüpleri ile yakın temastaydı ya da aralarına girmişlerdi. HH'lerin ve damar yapılarının villuslardaki sayıları anlamlı olarak ilişkili bulundu. Daha da ötesi, HH'lerin VEGF, Ang-2 ve Netrin-1'i eksprese ettikleri görüldü. Hatta HH yönlendirilmiş besiyerinin, özel bir matriks üzerinde kültüre edilen HUVEC hücrelerinin kapiller oluşturmasını indüklediği görüldü.Çalışmamız, HH'lerin makrofajik özelliklerinin yanında, plasenta için en önemli işlemlerden biri olan vaskülogenez ve anjiyogenezde yapısal olarak doğrudan, fonksiyonel olarak dolaylı rol aldıklarını gösteren ilk çalışmadır. Sonuçlarımıza göre, HH'ler vaskülogenez ve anjiyogeneze doğrudan katılırlar ve endotel hücreleri üzerinde anjiyogenik etkili faktörler salgılarlar. HH'lerin plasental vaskülogenez ve anjiyogenezdeki potansiyel fonksiyonel rollerinin belirlenmesi, normal plasentasyonu kontrol eden mekanizmaları ve intrauterin büyüme geriliği ile pre-eklampsi gibi plasentasyon sırasındaki vasküler gelişim bozukluklarının patofizyolojisini anlayabilmemize ışık tutacaktır.
Trifluralin uygulanmış erkek sıçanlarda resveratrolün ürogenital sistem üzerine terapötik etkilerinin histolojik ve biyokimyasal olarak araştırılması
AMAÇBu çalışmamızda dinitroalaninli bir herbisit olan Trifluralin (TRF)' in erkek sıçanların ürogenital sistemi üzerine olası olumsuz etkisine karşın resveratrol gibi güçlü bir antioksidan ile terapötik etkilerinin histolojik, histokimyasal, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak incelemeyi amaçladık.YÖNTEMDeneysel modelimizde Wistar suşu erkek sıçanlar 5 gruba (n=7) ayrıldı. I. grup, kontrol grubu; II. grup, sham grubu; III. grup, TRF Yüksek Doz (YD) grubu: 2 gr./kg./gün; IV. grup, TRF Düşük Doz (DD) grubu: 0,8 gr./kg./gün; V. grup, Resveratrol (RVT) tedavi grubu: 10 mg./kg./gün resveratrol + 2 gr./kg./gün TRF 21 gün süre ile mide gavajı yöntemiyle verildi. Işık mikroskobik incelemeler için kesitler Hematoksilen&Eozin (H&E), Masson Trikrom, Periyodik Asit Schiff (PAS) ile boyandı. İmmünohistokimyasal olarak apoptoz belirlenmesi için ise terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling (TUNEL) boyaması yapıldı. Biyokimyasal incelemeler için alınan dokularda superoxide dismutase (SOD), glutathion peroxidase (GPx) ve melondialdehit (MDA) düzeyleri incelendi. Kan ve idrar örneklerinde üre, kreatinin ve üre azotu (BUN) değerleri incelendi.BULGULARTrifluralin verilen gruplarda Hematoksilen-Eozin boyamalarda böbrek dokusunda, proksimal tübüllerde dejenerasyon, hücre döküntüleri, vasküler ve tübüler dilatasyon, vakuolizasyon tiroidizasyon ve nükleer atipi gözlendi. Testis dokusu tübüllerinde ise dilatasyon, yaygın nekroz, spermatogenik seriye ait hücre diziliminde düzensizlik, tübülerde debritler; seminifer tübül lümeninde spermiyum hücrelerinin azalması ve bazılarında görülmemesi gibi bulgular gözlendi. Üreter ve mesane dokularında herhangi bir histolojik ve morfolojik değişikliğe rastlanmadı. Peryodik Asit Schiff boyamada ve histomorfometrik incelemelerde böbrek dokusunda hücresel hasarlanma bulguları ve nekroza giden değişiklikler gözlendi. Testis dokusunda seminifer tübül bazal memranında ve intertitisyumda artış gözlendi. Masson Trikrom boyamalarında böbrek dokusunda peritübüler alanlarda nadir kollajen artışı gözlenirken üreter ve mesane dokularında normal histolojik bulgular hakimdi. TUNEL boyamasında böbrek ve testis dokusunda TRF Yüksek Doz ve TRF Düşük Doz gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı oranda TUNEL pozitif hücre artışı gözlenirken resveratrol tedavi grubunda kontrole yakın değerler gözlendi.Böbrek ve testis dokusunda kontrol grubu ile TRF YD ve TRF DD kıyaslandığında MDA düzeylerinde anlamlı artış, SOD ve GPx düzeylerinde ise anlamlı bir azalma gözlendi. Resveratrol Tedavi grubunda ise Doz gruplarına kıyasla MDA düzeylerinde anlamlı azalış ve SOD ve GPx düzeylerinde anlamlı artış saptandı. Üreter ve mesane dokularında ise bu parametrelerde anlamlı değişim gözlenmedi.Böbrek fonksiyon testi olarak kabul edilen Kan BUN ve Kreatinin seviyelerinde TRF YD ve TRF DD gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı artış tespit edildi. Resveratrol tedavi grubunda TRF deney gruplarına göre anlamlı azalma saptanırken kontrol grubuna göre anlamlı bir değişiklik bulunmadı. Ürik asit düzeylerinde ise kontrol grubuna kıyasla sadece TRF YD grubunda artış gözlendi. İdrar BUN ve Ürik asit düzeylerinde ise TRF YD ve TRF DD gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı düşüş gözlenirken, Kreatinin seviyelerinde sadece TRF YD grubunda anlamlı düşüş gözlendi.SONUÇElde ettiğimiz verilere dayanarak TRF'nin böbrek ve testis dokusunda oksidatif stresi arttırdığı, doku hasarı oluşturduğu ve biyokimyasal değişikliklere neden olduğu fakat üreter ve mesane dokularında uygulanan dozlarda hasar oluşturmadığı buna karşılık oluşan histolojik hasarı ve biyokimyasal değişiklikleri Resveratrolün anlamlı miktarda azalttığını gözlemledik.Anahtar kelimeler: Trifluralin, resveratrol, testis, böbrek, üreter, mesane, apoptoz.
Desert Hedgehog sinyal yolağının anormal spermatogenez ve testiküler kanser oluşumundaki rolünün araştırılması
Hedgehog (Hh) sinyal yolağı, birçok dokunun gelişimi sırasında düzenleyici olarak rol oynamakta ve bazı kanser türlerinde ekspresyonları artmaktadır. Hh sinyalinin, çeşitli kanser türlerinin oluşumunda katkı sağladığı kabul edilmesine rağmen, bu yolağın testis gelişimindeki rolü, yetişkin testisinde spermatogoniyal kök hücrelerdeki ekspresyonu ve spermatogenezdeki rolü henüz bilinmemektedir. Embriyonik gelişim sırasında, olgunlaşmasını normal olarak tamamlayamayan germ hücrelerinin, yetişkinlik döneminde testis kanseri ile ilişkilendirilmesinden dolayı, bu tez çalışmasında Hh'ların, normal gelişmekte olan testiste ve testis gelişiminin hasara uğradığı durumlarda, yetişkin testisindeki spermatogoniyal kök hücrelerde ve normal yetişkin spermatogenezindeki rolleri sorgulandı. Bu amaçla, Desert Hedgehog sinyal yolağının anormal spermatogenez ve testiküler kanser oluşumundaki rolü, in situ hibridizasyon, immünohistokimya, tübül damla kültürü ve qRT-PCR yöntemleriyle araştırıldı.Çalışmamızın sonuçları, spermatogenezin ilk dalgasında, Hh sinyal yolağının, erken embriyonik germ hücrelerinde aktivite gösterdiğini, doğum sonrası dönemdeki germ hücrelerinde sinyal aktivitesinin kaybolduğunu ve yetişkinlik döneminde, spermatogenezle beraber, Hh sinyalinin tekrar aktifleştiğini gösterdi. Radyasyona maruz kalan yetişkin sıçan testisi modeli kullanarak yaptığımız analizler sonucunda, Hh sinyal yolağının, yalnızca embriyonik dönemdeki testiküler kök hücrelerde değil ancak, yetişkin sıçan testisindeki farklılaşmamış spermatogoniyal kök hücrelerde de aktivite gösterdiği bulundu. İlginç olarak, hormonal çevrenin değişmesiyle birlikte, kök hücrelerin bir sonraki aşamaya farklılaşmasıyla Hh sinyalinin de aktivitesini yitirdiği gözlendi.Dibütilfitalat maruziyeti veya aktivin beta-A geninin knock-out edilmesiyle, embriyonik testis gelişiminin hasara uğradığı durumlarda, Hh sinyalinin ekspresyon şiddetinin de değiştiği gözlendi. Bu durum, anormal germ hücre gelişiminde, Hh sinyal yolağının da katkı sağlayabileceğini gösterebilir.Seminifer tübül damla kültürü yöntemiyle, Hh sinyal yolağı aktivitesinin, Hh inhibitörü olan Cyclopamine ile inhibe edilmesinin ardından, postnatal 1 günlük testiste, SCYP3 ve Stra8 gibi mayoz ilişkili genlerin up-regüle olduğu bulundu.Kemirgen testis dokularında, germ hücre gelişiminin özel aşamalarında rol oynadığı gösterilen Hh sinyal yolağının, insan testiküler kanserli dokularında da aktivite gösterdiği anlaşıldı.Bu tez çalışmasında bildirilen, Hh'ların gelişim farklı aşamasındaki testiküler hücrelerdeki ekspresyonlarıyla ilgili bilgiler, Hh sinyalinin, spermatogenezin özel basamaklarında aktif olduğunu ve çok sıkı bir şekilde denetlenerek, spermiogenezle kapandığını göstermektedir. Testis gelişim ve fonksiyonu sırasında bu derece kritik olan ve sıkı bir şekilde denetlenen Hh sinyal yolağında meydana gelebilecek herhangi bir hasarın, anormal spermatogenezle sonuçlanabileceği ve dahası testisküler kanser oluşumuna katkı sağlayabileceği söylenebilir.Anahtar Kelimeler: Desert Hedgehog sinyal yolağı, spermatogenez, testiküler gelişim, in situ hibridizasyon.
Fetal, neonatal, puberte ve erişkin fare testisinde PARP-1, PARP-2 VE PAR ekspresyonlarının araştırılması
İnsanda ve farede oldukça benzer olan testis gelişimi, somatik hücrelerin etkisiyle gerçekleşen ve hücre farklılaşması, apoptoz, mitoz ve mayoz bölünmeler gibi önemli biyolojik olayları içeren bir süreçtir. Germ hücrelerinin ve onların destek hücreleri olan Sertoli hücrelerinin fetal ve neonatal dönemlerdeki normal gelişimleri, yetişkin erkek üreme fonksiyonlarını belirlemektedir. Diğer bir deyişle, testis gelişimindeki morfolojik ve hücresel olayların düzenlenmesi, yetişkin testis özelliklerinin kazanılması için gereklidir. Poli ADP-ribozilasyon (PARlasyon), Poli ADP-riboz Polimeraz (PARP)'lar tarafından katalizlenen ve DNA zincir kırıklarıyla aktive olan hücresel bir cevaptır. PARP-1, PARP ailesinin en iyi tanımlanmış üyesidir. Erişkin testiste; PARP-1'in ve Poli ADP-riboz (PAR) polimerlerinin spermatogenik hücrelerdeki dağılımı ve germ hücre farklılaşmasında PARlasyonun rolü gösterilmiştir. PARlasyon, hedef proteinlere PAR polimerleri ekleyip onların aktivitesini düzenleyen bir postranslasyonel modifikasyondur. Ayrıca, PARP-2'nin spermatosit mayoz bölünmeleri ve spermiyogenezdeki anahtar rolü, PARP-2 geni silinmiş farelerin hipofertil olmaları ile kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, erişkin testisteki rollerinden yola çıkarak, PARP-1, PARP-2 ve onların ürünü olan PAR polimerlerinin; fetal, neonatal, pubertal testislerdeki ekspresyonları değerlendirilmiştir.Embriyonik (E) 15.5, E17.5, doğum sonrası (DS) 0, DS3, DS5, DS9, DS15, DS20 ve erişkin testis dokuları parafin bloklarından alınan seri kesitlere; PARP-1, PARP-2 ve PAR'ın dağılımlarını incelemek amacıyla immünohistokimya uygulanmıştır. Bunlara ek olarak; germ hücrelerin belirtilmesi için VASA (MVH), puberte öncesinde henüz farklılaşmamış pre-Sertoli hücrelerini göstermek için Anti-Müllerian Hormon (AMH) antikorları kullanılmıştır.PARP-1; E15.5, E17.5 ve PP0 günlerinde gonositlerde gözlenmiştir. PP3.günde; seminifer tübülün bazaline göç eden gonositlerde ekspresyonu devam etmektedir. PP5.günde; tübülün bazaline göç ederek spermatogonyumlara farklanan gonositlerde ekspre olmaktadır. PP9, PP15 ve PP20.günlerde spermatogonyumlarda, erişkin testis dokusunda ise; spermatogonyumların yanısıra intersitisyel alandaki hücrelerin nükleuslarında varlığı gösterilmiştir. PAR ekspresyonu, E15.5, E17.5, DS0, DS3, DS5, DS15, DS20. günlerde pre-Sertoli hücrelerinde gözlenirken, DS9. günde testiste PAR ekspresyonu görülmemiştir. Erişkinde ise; spermatogonyumlarda ve intersitisyel alandaki hücrelerin nükleuslarında PAR ekspresyonu gözlenmiştir. PARP-2 ekspresyonu; E15.5, E17.5, DS0, DS3. günlerde gonositlerde izlenirken DS5.günde spermatogonyumlarda görülmemiştir. DS9, DS15 ve DS20. günlerde PARP-2 ekspresyonu, spermatogonyumlarda ve spermatositlerde izlenmiştir. E15.5, E17.5 ve DS0-DS20. günlerde, Sertoli hücrelerinde ekspresyonu devam eden PARP-2, erişkinde ise; Sertoli sitoplazmasında, spermatositlerde ve uzayan spermatidlerde gözlenmiştir.Bu çalışmada; PARP-1, PARP-2 ve PAR'ın testis gelişim sürecinde somatik ve germ hücrelerindeki ekspresyonları ilk defa gösterilmiştir. Sonuçlarımız, erişkinde erkek fertilitesi için önemli olduğu bildirilen bu moleküllerin, embriyonik ve pre-pubertal testis gelişiminde de rolleri olabileceğini ortaya koymaktadır.Anahtar Kelimeler: Fare testis gelişimi, PARP-1, PARP-2, PAR, immünohistokimya
Normal ve patolojik plasentalarda hücre siklusu proteinlerinden PCNA, Ki67, siklin D3, p27 ve p57'nin immünohistokimyasal dağılımı
Plasenta, anne ile fetüs arasındaki birçok metabolik aktiviteyi düzenleyen bir organdır. Bu nedenle fetal gelişim, plasental gelişime bağlıdır. Plasental gelişim trofoblast hücrelerinin koordineli olarak proliferasyonuna, differensiyasyonuna ve invazyonuna bağımlı olaylar serisidir. Ancak bu olayları kontrol eden hücre siklusunda görevli proteinler hakkında bilinenler oldukça sınırlıdır.Plasenta dokusundaki proliferasyonun preeklampsi (PE), diyabet ve intrauterin büyüme geriliği (IUGR)'nden nasıl etkilendiği henüz tam olarak bilinmemektedir. Bu yüzden bu çalışmada normal, preeklamptik, diyabetik ve IUGR'lı plasentalardaki differensiyasyon, proliferasyon ve apoptoz mekanizmalarında PCNA, Ki67, siklin D3, p27 ve p57 gibi hücre siklusunda görevli proteinlerin immünohistokimyasal lokalizasyonları incelendi.Çalışmada 3 preeklampsi, 3 diyabet, 3 IUGR ve 3 normal gebelik olgusuna ait toplam 12 insan term plasentası kullanıldı. Rutin doku takibi sonucunda dokular parafine gömüldü. Gömülen doku örneklerinden hazırlanan kesitler immünohistokimya yöntemi ile PCNA, Ki67, siklin D3, p27 ve p57 antikorlarıyla boyandı ve ışık mikroskobunda incelendi.PCNA, Ki67 ve siklin D3 boyanma yoğunlukları, PE ve diyabet gruplarının villuslarında kontrole göre anlamlı şekilde artarken, PE grubunun bazal plaklarında da anlamlı şekilde azaldı. PE plasentaların tüm bölgelerinde p27 ve p57'nin boyanma yoğunlukları anlamlı şekilde arttı. Diyabetik grubun koryonik plaklarındaki p27 ve p57'nin boyanma endeksleri ise kontrole göre anlamlı şekilde azaldı. IUGR grubuna ait plasentaların tüm bölgelerinde ise PCNA, Ki67 ve siklin D3 boyanma yoğunlukları kontrole göre anlamlı şekilde azaldı. IUGR grubunun villuslarındaki ve koryonik plaklarındaki p27 boyanma yoğunluğu anlamlı şekilde artarken p57 boyanma yoğunluğu da IUGR grubunun tüm bölgelerinde kontrole göre anlamlı şekilde fazlaydı.Sonuç olarak hücre siklusuna ait proteinlerden PCNA, Ki67, siklin D3, p27 ve p57 normal ve patolojik plasenta gelişiminde rol almaktadır. Bu proteinlerin patolojik plasentalardaki immünoreaktiviteleri ile plasentaların büyüklükleri arasında ilişki mevcuttur.
Polikistik Over Sendromu (PCOS)'nda mTOR (The Mammalian Target of Rapamycin) Mekanizması
PCOS yaygınlığı, farklı tanı kriterlerine göre değişmekle beraber, genel olarak doğurganlık çağında % 5-10 civarında izlenen, üreme çağındaki kadınlarda en sık rastlanan reprodüktif endokrinopati olarak gösterilmiştir.mTOR (The mammalian target of rapamycin), hücre içerisinde hücrenin büyümesi, çoğalması, metabolizma ve anjiyogenez gibi pekçok işlemde görev almaktadır. Yapılan son çalışmalarla mTOR yolağı ovaryum folliküllerinde de incelenmiş, granuloza hücrelerinin çoğalması ve farklılaşmasında görev aldığı belirlenmiştir.Polikistik over sendromunda, foliküllerde yer alan granuloza hücreleri hızlı bir bölünme göstermektedir. Böylelikle foliküllerin ve dolayısıyla ovaryumun hacimsel bir artışı söz konusudur. PCOS olan hastaların overlerinde yüksek düzeyde granuloza ve teka hücresi proliferasyonu gerçekleşmektedir. Bu durum bize; mTOR sinyal yolağının, PCOS'da granuloza ve teka hücrelerinin yüksek düzeydeki proliferasyonundan sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. Bu çalışmamızda, mTOR sinyal yolaklarından birinin ya da her ikisinin (TORC1 ve TORC2) PCOS mekanizmasında rol alabileceğini düşünmekteyiz. Buradan yola çıkarak, PCOS oluşturulan fare modelinde mTOR sinyal yolağının/yolaklarının etkili olup olmadığını belirlemeyi amaçlıyoruz.Çalışmamızda 25 günlük toplam 30 adet BalbC türü fare kullanılarak 3 grup oluşturuldu: İlk grup herhangi uygulamanın yapılmadığı kontrol grubu (K) (n=10), ikinci grup PCOS grubu (P) (n=10) (6 mg/100g DHEA'nun 0.1 ml susam yağı içerisinde çözülerek günlük subkutan olarak verildiği grup), Üçüncü grup yalnızca çözücünün verildiği (sadece susam yağı verilen) (Ç) (n=10) grup. Çalışmamızda gruplar arasındaki morfolojik farkı ortaya koymak amacıyla hematoksilen-eozin boyaması yapıldı. Çoğalan granuloza hücrelerini göstermek amacıyla mTOR ve P-mTOR (serine 2448) antikorları ile çiftli immünohistokimya yöntemi uygulandı. mTORC1, mTORC2 kompleksleri ile P70S6K, P-P70S6K ve PKCalpha, P-PKCalpha antikorları için western blot ve RT-PCR yöntemleri uygulandı. Gruplar arasındaki östradiol ve progesteron seviyelerini karşılaştırmak amacıyla da ELISA tekniği kullanıldı. Tüm sonuçların istatistiksel analizleri Sigma Stat 3.0. Student t-testi kullanılarak yapıldı.Çalışmamızda ilk defa PCOS fare modelinde mTORC1 ve mTORC2 kompleksleri ile bu komplekslerin ürünleri incelenmiştir. Sonuçlarımız PCOS fare modelinde mTORC1 ve mTORC2-aracılı sinyal yolaklarının aktivasyonunun PCOS'lu fare ovaryumunda önemli bir role sahip olabileceğini göstermektedir. Bu bulgular her iki kompleksin de (TORC1 ve TORC2) PCOS'da artan granuloza ve teka hücre proliferasyonundan sorumlu olabileceğini göstermektedir.Sonuç olarak mTORC1 ve mTORC2 sinyal yolaklarının denetlenmesi; PCOS'un önemli bir semptomunu oluşturan ovaryal kistlerin oluşumunun engellenerek; folikül büyümesi ve oosit gelişimindeki sorunların çözümlenmesine ve anovulasyona bağlı kısırlık sorununa yaklaşımda, yeni stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Fare ovaryumunda protein kinaz c izotiplerinin dağılımı ve folikülogenezle ilişkisi
Protein Kinaz C (PKC) 12 farklı üyeden oluşan cAMP bağımsız bir protein kinaz ailesidir. Bu aile, üç farklı alt aileye bölünebilir. Klasik PKC'lerin tümü (a, b1, b2, g) fosfolipidler, diaçilgliserol (DAG) ve Ca2+ tarafından aktive edilirken; novel PKC'ler (d,e, h, q, m) aktivasyon için Ca2+ `a gerek duymazlar. Atipik PKC'ler (l, i, x) DAG ve Ca2+ `a yanıt vermezler, ancak aktivasyon için fosfolipidlere ihtiyaç duyarlar. PKC'lerin memeli ovaryumlarında granuloza hücre proliferasyonu, ovosit maturasyonu, ovulasyon ve luteinizasyon ile ilgili kritik rolleri olduğu düşünülmektedir. PKC'lerin farklı hücresel olayları kontrol ettiği bilinse de farklı PKC izotiplerinin memeli ovaryumunda gösterdiği dağılım bugüne kadar açıklığa kavuşmamıştır. Bu çalışmanın amacı prepubertal, pubertal ve erişkin döneme ait fare ovaryumlarında farklı PKC izotiplerinin özgün dağılımlarını göstermektir.Çalışmamızda gonadotropin reseptörlerinin transkriptlerinin tam olarak oluşmadığı prepubertal evredeki 1 günlük, gonadotropin reseptörlerinin oluşmasından sonraki evrede bulunan 7 günlük, foliküllerin gonadotropinlerden bağımsız olarak sekonder aşamaya kadar gelişebildiği pubertal evredeki 21 günlük ve erişkin evredeki 60 günlük BalbC türü farelerden alınan ovaryum dokularına rutin parafin kesit teknikleri uygulanarak üç farklı PKC izotipinin (PKCa, PKCd, PKCe) ve bunların fosforile formlarının (pPKCa, pPKCe) ovaryum kesitlerindeki lokalizasyonu immunohistokimyasal teknikler kullanılarak belirlenmiştir.PKCa'nın gelişen ovaryum foliküllerindeki ovosit ve granuloza hücrelerinde ve korpus luteumun luteal hücrelerinde yerleşim gösterdiği, immünoreaktivitesinin farklı gelişim aşamasındaki foliküllerde ve prepubertal evrede farklılık gösterdiği görülmüştür. PKCd'nın ovaryum foliküllerinin granuloza hücrelerinde ovositlere göre daha yoğun immünoreaktivite gösterdiği, korpus luteumun luteal hücrelerindeki immünoreaktivitesinin PKCa kadar yoğun olmadığı ve prepubertal evrede immünoreaktivitesinin değiştiği belirlenmiştir. PKCe'un ise tüm gruplara ait ovaryumlarda farklı gelişim aşamalarındaki tüm foliküllerde spesifik olarak ovositlerde lokalizasyon gösterdiği belirlenmiştir. Luteal hücrelerde immünpozitif reaksiyon görülmemiştir.Sonuç olarak PKCa, PKCd ve PKCe farklı gelişim dönemlerindeki ovaryumlarda farklı hücrelerde özgün yerleşim göstermektedir. Çalışmamızın sonuçları PKC izotiplerinin ovaryumdaki özgün rollerinin araştırılmasına ve diğer sinyal yolakları ile ilişkilerinin belirlenmesine ışık tutacaktır.Anahtar Kelimeler: PKC, ovaryum, ovosit, granuloza, immunohistokimya
Farede spermatogenez boyunca metilasyon imprintlerinin meydana getirilmesinde Boris geninin rolü
BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites; CTCFL), genetik olarak imprinte genlerin ekspresyonuna katılan bir proteindir. Ekspresyonu, erişkin vücudunda normal koşullar altında sadece testiste, bunun dışında malignant hücrelerde ve kök hücrelerde belirlenebilmiştir. Genlerin doğru bir şekilde ekspre olmasının, fertilizasyon ve sonrasında fetüsün gelişimi için ne kadar önemli olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, çalışmamızda, genetik mühendisliği teknikleriyle Boris gen ekspresyonunun değiştirildiği transgenik fareler kullanıldı. Boris'in normal spermatogenez, erkek fertilitesi (in vivo ve in vitro olarak) ve fetal büyüme ve yaşayabilirlik üzerindeki etkileri araştırılarak, Boris'in H19/Igf2 bölgesi gibi önemli bir imprinting lokusunda doğru metilasyon imprintlerinin oluşmasındaki olası rolü ortaya konuldu.Fare Boris geni mutant ve normal olmak üzere iki farklı formda, GFP (yeşil fluoresan protein) ve tetrasiklin (Tet) duyarlı element içeren iki yönlü Tet plasmidine (pTRE-Tight-Bl-AcGFP1) klonlandı. Bu sistem Boris transgeni ekspresyonunun sadece testiste ve tetrasiklin analoğu olan doksisiklin varlığında görülebilmesine imkan sağladı. Elde edilen plasmid, fare zigotlarına enjekte edildi. Genotipleme ile tespit edilen kurucu (ata) Boris transgenik fareler, testise özgü ekspresyon için testis-spesifik promoterlerin bulunduğu Protamin Cre veya Snaptonemal kompleks Cre transgenik fare soyları ve indüksiyon için tetrasiklin-kontrollü transaktivatör protein (rtTA)'e sahip rtTA transgenik fare soyları ile çiftleştirildi. Doksisiklin (2mg/ml) muamelesine tabi tutulan farelerin testislerinden RNA izolasyonu yapılarak kantitatif gerçek zamanlı PCR metodu uygulandı. Testis örnekleri ışık ve fluoresan mikroskopla incelendi. Proliferasyon indeksleri (PCNA) ve apoptotik hücre oranları hesaplandı. Bu fareler ile çiftleştirilen dişi farelerin gebelikleri doğuma kadar takip edilerek yavrulardaki embriyonik hasarlar değerlendirildi. Bisülfit sekanslama analizleri yapılarak H19 DMD metilasyonu araştırıldı.Çalışmamızın sonuçları, Boris transgenik fare soylarının fertil olduğunu ancak Boris proteini ve spermatogenez arasında potansiyel bir ilişki olabileceğini işaret etmektedir. Doksisiklin ile muamele edilmiş mutant ve normal Boris transgenik fare yavruları, kontrol gruplarına göre daha düşük vücut ağırlığına sahip iken yüksek postnatal mortalite oranı göstermiştir. Etkilenen yavruların birçok organ yapısında büyüme geriliği tespit edilmiştir. Ayrıca yetişkin ve yavru Boris transgenik fare DNA'sında H19 DMD metilasyonu kontrollere göre farklı bulunmuştur.Çalışmamız, Boris geni ile embriyogenez ve fetal gelişim bozuklukları arasındaki ilşkiyi ortaya koyan literatürdeki ilk çalışmadır. Gelecek çalışmalarımız, embriyogenez boyunca Boris geninin anormal ekspresyonunun nasıl olup da normal gelişimi değiştirebildiğine dair olası mekanizmalar üzerinde yoğunlaşacaktır.
Endometriyal endotel hücrelerinde in vivo BİP ekspresyonu ve BİP'in inflamatuar sitokinler TNF-alfa ve İnterlökin 1 (IL-1) beta tarafından in vitro düzenlenmesi
Amaç:Bu tezde insan endometriyal endotel hücre (HEEC) lerinde inflamatuvar sitokinlerin etkisiyle meydana gelen endoplazmik retikulum (ER) stresine bağlı katlanamayan protein cevabın (UPR) düzenlenmesinin incelenmesi hedeflendi.Yöntem:Çalışmada in vivo menstrual siklusun ve erken gebeliğin farklı dönemlerine ait 35 doku örneğinde BİP ile immunohistokimya boyamaları yapıldı. İn vitro olarak ise HEEC izolasyonu ve kültürü yapıldı. Kültürdeki HEECler pasajlandıktan sonra 4 gözlü lamlara ve 96 gözlü mikropleytlere ekildi. 4 gözlü lamlara ekilen HEECler inflamatuvar sitokinlerle 24 ve 48 saat uyarıldı. Deney sonunda fikse edilen HEEClere BİP, fosfo- ve total-eIF-2? immunositokimya ve TUNEL tekniği uygulandı. Doksan altı gözlü mikropleytlere ekilen HEECler ise, 24 ve 48 saat inflamatuvar sitokinler, UPR inhibitörü TUDCA ve UPR uyaranı tunikamisinle uyarılarak MTS ve ELİSA teknikleri ile analiz edildi. Ayrıca inflamatuvar sitokinler ve ovaryan hormonlarla sitimüle edilen HEEClerde BİP ve eIF-2?'nın seviyesi ve eIF-2?'nın fosforilasyon düzeyi Western blot tekniği ile belirlendi.Bulgular:İn vivo endometriyal doku ve erken gebeliğe ait desidual doku endotel hücrelerinde, BİP immunoreaktivitesinin HSCORE değerlendirilmesi ile normal menstrual siklus boyunca geç sekresyon fazında en yüksek; erken gebelikte ve orta sekresyon fazında ise en düşük BİP immunoreaktivitesi saptandı.İn vitro koşullarda tunikamisinle uyarılan HEEClerde kontrole kıyasla, MTS sonucunda ortaya çıkan hücre sayısındaki anlamlı azalmanın, doz bağımlı olduğu izlendi. Ayrıca, IL- ?? 'nın kontrole göre hücre sayısındaki arttırıcı etkisi TUDCA ile birlikte verildiğinde, ortadan kalktı.TUNEL tekniği kullanılarak TNF-? ile uyarılmış HEEClerde kontrole kıyasla daha fazla apoptoza uğramış hücre görüldü.HEEClerin tunikamisin ile doz bağımlı olarak ve TNF-? ile uyarıldığında IL-8 sekresyonunu anlamlı olarak arttırdığı saptandı. Tunikamisinin bu etkisinin, TUDCA ile birlikte uygulandığında anlamlı olarak azaldığı gözlendi. TUDCA, TNF-?'nın da anlamlı etkisini ortadan kaldırdı.Ovaryum steroidleri ile uyarılmış HEEClerde BİP ve eIF-2? protein seviyesi, kontrole göre anlamlı bir farklılık göstermedi, fakat eIF-2?'nın fosforilasyon seviyesi incelendiğinde progesteronun; kontrol, östrojen ve östrojen+progesteron gruplarına kıyasla anlamlı olarak azaltıcı etkisi saptandı. Ayrıca, HEEClerin inflamatuvar sitokinlerle uyarılması sonucunda BİP seviyesinin ve eIF-2? proteininin fosforilasyon seviyesi kontrole göre anlamlı olarak artış gösterdi. Aynı deneyin immunositokimyasal analizleri de bu Western blot sonuçlarımızla paraleldi.Sonuç:Bulgularımıza dayanarak UPR sinyal yolağının insan endometriyumununda endotel hücre proliferasyonun ve apoptozunun moleküler kontrolünde rol aldığını ve bu sürecin menstrual siklus bağımlı olarak kontrol edildiği söylenebilir. Ayrıca bulgularımız inflamatuvar sitokinler TNF-? ve IL-1ß'nın HEEClerde UPR sinyalinin aktivasyonundan sorumlu moleküllerden iki tanesi olabileceğini göstermektedir.
Deneysel olarak hipertansiyon ve diyabet oluşturulmuş ratlarda glomerüler değişikliklerin elektronmikroskobik ve immünohistokimyasal olarak incelenmesi
Diabetes Mellitus ve hipertansiyonun birlikte seyretmesi böbrek hasarı üzerinde ilerletici etki göstermektedir. Bu çalışmada, ayrı ayrı ve birlikte deneysel diyabet ve nefrektomi modelleri uygulandı ve bu hastalıkların böbrek üzerindeki etkilerinin ultrastrüktürel ve immunhistokimyasal olarak değerlendirilmesi ve bir antioksidan olan lipoik asidin olası tedavi edici etkisinin incelenmesi amaçlandı.Çalışmamızda Wistar suşu ratlar 8 gruba (n=7) ayrıldı. I. grup; Kontrol, II. grup DM, III. grup; 5/6 Nf, IV. grup LA, V. grup 5/6 Nf+DM, VI. grup DM+LAT, VII. grup 5/6 Nf+LAT ve VIII. grup 5/6Nf+DM+LAT. Diyabet modeli 45mg/kg STZ enjeksiyonu ile oluşturuldu ve hipertansiyon modeli için 5/6 nefrektomi modeli uygulandı. dl-?-Lipoic acid 30mg/kg/gün olacak şekilde 8 hafta oral gavaj yöntemi ile deneklere uygulandı. Böbrek dokusu HE, Masson Trikrom ve PAS boyası ile boyandı. İmmünohistokimyasal olarak AT1, VEGF ve ET-1ve Kazpaz-3 antikorları işaretlendi. Ultrastrüktürel olarak GBM ve bowman dış yaprak kalınlıkları ölçüldü. Biyokimyasal olarak kan örneklerinde kreatinin ve BUN değerleri incelendi.Diyabet ve nefrektomi modellerinin ayrı ayrı ve birlikte uygulandığı deneysel gruplarda glomerüllerde, glomerüloskleroz yapıları, mononükleer hücre infiltrasyonu, intersitisiyel fibrozis, damarlarda ve tübüllerde dilatasyon ve hiyalin materyal birikimi ile tübüler yapıların dejenerasyonu gözlendi. Renal hasar histomorfometrik olarak değerlendirildiğinde bowman dış yaprak kalınlığı, glomerül çapı, glomerül/çekirdek oranı, bowman dış yaprak kalınlığı, renal skar alanı ve glomerüloskleroz değerleri ve ultrastrüktürel olarak GBM ve BDYK'ları diyabet ve nefrektomi uygulanan gruplarda artmıştı. Tübülointersitisiyel ve glomerüler AT1 azalırken, VEGF, ET-1 ve Kaspaz-3 artış göstermişti. Aynı gruplarda kreatinin ve BUN değerleri artmıştı. LA verilen gruplarda ise değerlerin kontrol grubuna yakın olduğu gözlendi.Elde ettiğimiz veriler ışığında, diyabet ve hipertansiyonun birlikte gözlenmesinin böbrek hasarının hızlı ilerlemesine neden olduğu, lipoik asidin bu hastalıklara karşı böbrek üzerinde koruyucu/tedavi edici etkisinin olduğu sonucuna varıldı.
Kemoterapiye maruz kalmış dişi sıçanlarda Rosiglitazone'un ovaryuma etkisi
Amaç: Çalı?mamızda kemoterapötik bir etken madde olan ve ovaryum üzerindeki etkileri geri dönü?ümsüz olan siklofosfamidin yarattığı ovarial hasarda; PPARG reseptörlerine bağlanarak etkin hale gelen antienflamatuar, anjiyogenik ve immün hücre aktivasyonu üzerindeki baskılayıcı etkileri bilinen Rosiglitazone? un etkilerini ara?tırmayı amaçladık. Yöntem: Deney gruplarımız a?ağıdaki gibi tasarlandı. Kontrol grubu: Hiçbir uygulamaya maruz kalmayan deney grubudur. (n=7) I. Grup Kemoterapi grubu: 100mg/kg siklofosfamid uygulanan deney grubu. Enjeksiyon veya oral herhangi bir tedaviye yönelik ilaç uygulanılmadı, deney grubu diğer gruplarla aynı sürede sakrifiye edildi. (n=7) II. Grup Rosiglitazone deney grubu: 100mg/kg siklofosfamid uygulamasından 3 gün önce ve 15 gün sonra olmak üzere toplamda 18 gün 3mg/kg dozunda rosiglitazone %0.9?luk NaCl? de çözünerek oral gavaj yöntemiyle verildi. Son doz uygulamasından 24 saat sonra deney grubu sakrifiye edildi. (n=7)III. Grup Kemoterapi+NaCl deney grubu: 100mg/kg siklofosfamid uygulamasından 3 gün önce ve 15 gün sonra olmak üzere toplamda 18 gün deney grubuna rosiglitazone eklenmemi? %0.9?lu NaCl solüsyonu oral gavaj yöntemiyle verildi. Son uygulamadan 24 saat sonra deney grubu sakrifiye edildi. (n=7)Deney sonrasında sakrifiye edilen deneklerden alınan ovaryum dokularından alınan kesitler H&E ve Masson?s Trikrom boyanarak incelendi. ?mmünohistokimyasal olarak TUNEL boyaması gerçekle?tirilen kesitlerde TUNEL pozitif boyanan hücrelerin sayılmasıyla DNA fragmantasyonu değerlendirildi. Ovaryum dokularından alınan 4 kesitte folikül sayıları değerlendirildi. Folikül sayıları primordial, preantral ve antral olarak sınıflandırılarak istatistiksel değerlendirmeye alındı. Bulgular: Kontrol grubunun histolojik incelemesinde ovaryum dokusu normal gözlenirken kortekste çok sayıda primordial, primer, sekonder ve olgun foliküller, birkaç korpora lutea ve ovarial siklusa bağlı olarak az sayıda atretik folikül gözlendi. Medullada kan damarları ve gev?ek bağ doku normal görünümdeydi. Grup 1: Kemoterapi grubunda kortekste yer alan özellikle geli?mekte olan (primer, sekonder) foliküllerde ve olgun foliküllerde yaygın apoptoz, vakuolizasyon görüldü. Kortekste olgun ve sekonder foliküller, ayrıca korpora lutea çevresinde bağ doku artı?ı göze çarparken kortikal fibrosisin geli?tiği alanlar gözlendi. Grup 2: Rosiglitazone deney grubunda yine kemoterapiye bağlı atretik foliküller ve geli?mekte olan foliküllerde apoptoz birinci ve üçüncü gruba göre daha az oranda görüldü. Kortikal fibrosise bu grupta rastlanmazken foliküller çevresinde de kollajen artı?ı görülmedi. Grup 3: Kemoterapi + NaCl grubunda birinci gruba benzer ?ekilde apoptoz ve vakuolizasyon yaygındı. Yine kortekste fibrotik alanlar göze çarparken korpora lutea çevresinde kollajen artı?ı görüldü.TUNEL boyamasında DNA fragmantasyonu değerlendirildiğinde kontrol grubu da dahil olmak üzere apoptoz görüldü. Kontrol grubundaki apoptoz ovaryal siklusun normal süreci olarak kabul edildi. Grup 1 ve Grup 3?te kontrol grubuna göre TUNEL pozitif hücre sayısı fazla iken bu artı? istatistiksel olarak bir anlamlılık ifade etmedi. TUNEL pozitif hücre sayısı Grup 2?de kontrol grubuna oranla daha az iken yine bu fark istatistiksel olarak anlamlı bir fark değildi. Grup 2 Grup 1 ve Grup 3?e oranla daha az sayıda TUNEL pozitif hücre içerirken, bu fark sadece Grup 1 ile istatistiksel anlamlılık gösterdi. Kontrol grubu primordial folikül sayısı Grup 1, Grup 2 ve Grup 3?ten istatistiksel olarak anlamlı ölçüde fazla bulundu. Grup 2?ye ait primordial folikül sayısı Grup 1 ve Grup 2?den istatistiksel olarak daha fazlaydı. Grup 1 ile Grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmedi. Kontrol grubu preantral folikül sayısı Grup 1 ve Grup 3?ten istatistiksel olarak anlamlı ölçüde fazla bulundu. Kontrol grubu ile Grup 2 preantral folikül sayısı arasında istatistiksel bir farklılık görülmedi. Grup 1 ile Grup 2 ve Grup 3 arasında preantral folikül sayısı açısından bir farklılık bulunmadı. Grup 2 preantral folikül sayısı Grup 3?ten istatistiksel olarak anlamlı bir ?ekilde fazlaydı. Kontrol grubu antral folikül sayısı Grup 1 ve Grup 3?ten istatistiksel olarak anlamlı ?ekilde fazla bulundu. Kontrol grubu ile Grup 2 antral folikül sayısında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmedi. Grup 1 ile Grup 2 ve Grup 3 arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmazken; Grup 2 antral folikül sayısı Grup 3 ?ten istatistiksel olarak anlamlı ?ekilde fazla bulundu. Korpora lutea sayıları arasında anlamlı bir fark tespit edilmedi. Sonuç:Çalı?mamızda siklofosfamidin ovaryum üzerindeki apoptotik etkisi hem histolojik hem immünohistokimyasal hem de moleküler tekniklerle, fibrotik etkisi ise ı?ık mikroskobik olarak gösterilmi?tir. Rosiglitazone?un çalı?mada kullanılan dozuyla siklofosfamidin ovaryum üzerindeki apoptotik etkisini azalttığı gösterilmi?tir. Ayrıca siklofosfamidin neden olduğu ovarial folikül rezervindeki azalmaya, preantral ve antral foliküllerdeki dejenerasyona kar?ı Rosiglitazone?un koruyucu bir etkisi olduğu ilk kez ortaya koyulmu?tur. Ancak Rosiglitazone?un siklofosfamid toksisitesinden koruyucu etkisinin daha iyi anla?ılabilmesi için gelecek çalı?malarda daha farklı dozçalı?malarının denenmesi ve foliküller üzerindeki koruyucu etkisinin mekanizmalarının ara?tırılması gerekmektedir. Anahtar Sözcükler: Rosiglitazone, Siklofosfamid, Ovaryum, Apoptoz, Primordial Folikül.
Dondurma öncesi ve sonrası oosit ve embriyolarda UPR (Unfolding protein response ) sinyal yolunun araştırılması ve preimplantasyon embriyo gelişimine etkisinin araştırılması
AMAÇ Bu çalışmamızda, ER stresinin preimplantasyon embriyo gelişimine olan etkisini ve dondurma (kriyoprezervasyon) çözme tekniğinin oosit ve embriyolarda yaratabileceği olası ER stresine bağlı olumsuz etkiyi Immünofloresan, Western Blot ve RT-PCR yöntemleri ile incelemeyi amaçladık.YÖNTEM Deneysel modelimiz C57BL/6 dişi farelerden superovulasyonu ve in vivo fertilizasyonu takiben iki hücreli embriyolar toplandı .Embriyolar üç gruba ayrıldı: I. Kontrol n=6, II. Tunikamisin (0.5 µg/ml; n=6), III. Sikloheximid (10 µg/ml; n=6), bu gruplar preimplantasyon süreci boyunca inkübe edildiler (2.günden 4. güne kadar) ve gün gün gruplar arasında karşılaştırmalı gelişim analizi yapıldı. İkinci set deneyimiz, kontrol (n=12), kısa dönem tunikamisin (n=12) ve uzun dönem tunikamisin (n=12) ile inkübe edilen deney gruplarından oluşturularak, kısa süreli yada uzun süreli UPR aktivasyonunun etkisi preimplantasyon embriyo gelişiminde araştırıldı. Benzeri olarak üçüncü set deney gruplarımızda elde edilen iki hücreli embriyolar ve olgun oositler 3 gruba ayrıldı; I. grup kontrol, II. grup vitrifikasyon grubu, III. grup yavaş dondurma grubu. Oosit ve embriyolar morfolojik değerlendirmeyi takiben ER stress molekülleri olan BiP ile protein düzeyinde ve BiP, XBP-1 ve sXBP-1 ile de mRNA seviyesinde analiz edildi.BULGULAR Sikloheksimid grubundaki embriyoların preimplantasyon embriyo gelişim süreci boyunca iki hücreli aşamada kaldıkları gözlenirken, kontrol ve tunikamisin gruplarındaki embriyoların preimplantasyon üçüncü günde 8 hücreli aşamayı takiben morfolojik bir fark olmaksızın kompaksiyon düzeyine geldikleri gözlendi. Dördüncü günde ise kontrol grup embriyoların hepsi blastosist aşamasında iken tunikamisinli medyum ile inkübe edilen embriyoların hiçbirinin blastosist aşamasına gelemediğini gözlemledik. Dahası kontrol, kısa dönem ve uzun dönem tunikamisinle inkübe edilen embriyolarda blastosist formasyon oranı sırasıyla; %100, %33, ve %0 idi. Vitrifikasyon ve yavaş dondurma ile dondurulup çözülen oosit/embriyolarda kontrol gruplarına oranla daha yüksek BiP immüno reaktivitesi saptandı. Western blot analizi sonucunda dondurulup çözülen oosit/embriyolar da dondurulmamış gruplardaki oosit/embriyolara oranla daha yüksek BiP protein seviyesi gözlendi ve buna ek olarak RT-PCR analizlerinde dondurulup çözülen oositler/embriyolarda daha yüksek BiP ve sXBP-1 seviyesi saptandı. Ayrıca, yavaş dondurulup çözülen embriyolarda Immünofloresan, Western blot ve RT-PCR analizlerinde vitrikiasyon ile dondurulup çözülen embriyolara oranla daha yüksek BiP seviyesi saptandı.SONUÇ Sonuçta bulgularımız, gelişim sürecindeki embriyoların UPR sinyal yolağını aktive edebilen ER stresinin, preimplantasyon embriyo gelişim sürecine olan etkisinin çok büyük olduğunu göstermiştir. Kısa veya uzun dönem UPR sinyal moleküllerinin aktivasyonu embriyoların kompaksiyon aşamasından sonra gelişimlerini duraklatmaktadır. Dondurma çözme deneylerimiz sonrasında oosit ve blastosistlerin ER stresi aracılı UPR sinyal yolaklarının aktive olmasınun preimplantasyon gelişimide etkisi olduğunu göstermiştir.
Gebelik dönemminde elektromanyetik alana maruz bırakılan ratlarda ve yavrularda Melatonin'in tiroid bezi üzerine etkilerinin incelenmesi.
Gebelik Dönemminde Elektromanyetik Alana Maruz Bırakılan Ratlarda ve Yavrularda Melatonin'in Tiroid Bezi Üzerine Etkilerinin İncelenmesiBu çalışmada, günlük yaşamda sık karşılaşılan 50 Hz titreşimli elektromanyetik alanın (EMA), gebelik döneminde anne ve yavru sıçan tiroid bezi üzerine etkilerine ve bu etkilere melatoninin koruyucu etkisi olup olmadığıa araştırıldı. Çalışmamızda östrus siklus takibi ardından, gebe kalması sağlanan 28 Wistar albino rat rasgele seçilerek 4 gruba (her grup 7 denek) ayrıldı. Grup I: kontrol, Grup II: sham EMA cihazı çalıştırılmadan denekler 4 saat boyunca bu cihazın içinde tutuldu + Melatonin verildi, Grup III: EMA'a maruz kalan, Grup IV: EMA'a maruz kalan + Melatonin verilen grup. Sıçanlar gebeliğin 8. gününden doğum yapana kadar her gün 4 saat boyunca EMA'a (3 mikT, 50Hz) maruz bırakıldı. Melatonin gebeliğin 8'inci gününden itibaren her gün (grup II ve IV) gündüz saat 10'da 4 mg/kg ( 0.1 ml/100 g) intraperitoneal (IP) olarak verildi. Melatonin verilmeyen gruplara ise aynı zamanda fizyolojik salin (0.1 ml/100 g) %5 etanol ip olarak verildi. Doğum sonrası, anne sıçanlar ve yeni doğan yavruların rutin histolojik takipten sonra tiroid dokuları alınarak H&E, Mallory anilin Blue, PAS ve immunhistokimya (TUNEL ve Caspase 3) ile boyanarak histolojik değerlendirme ve morfometrik ölçümler yapıldı. Ayrıca ultrastrukturel düzeydeki değişiklikler, transmissiyon elektron mikroskobu ile değerlendirildi. İmmunhistokimya (TUNEL ve Caspase 3) değerlendirmeye göre EMA'a maruz kalan anne ve yavru sıçanlarda hücresel hasarın ve apoptozun artmış olduğu gözlendi. Histopatolojik ve morfometrik değerlendirmeye göre, EMA'a maruz kalan sıçanların, kontrol, sham ve EMA'a maruz kalan + Melatonin verilen gruplara göre TUNEL pozitif ve hasarlı hücre sayısının artması, tiroid follikül çap ölçümünde follikül çapların azalması, intrafoliküller kollidin azalması, , interfolliküler bağ dokusunun hacminin artması gibi bulgular saptandı. Tiroid follikül hücrelerin ultrastrukturel analizinde EMA'a maruz kalan grupta, yoğun heterokromatin ve düzensiz çekirdek, sitoplâzmada kolloid damlacıkların oluşumu, rER'mda dilatasyon ve silindirikli mitokondriler gibi değişiklikler gözlendi. Bu değişikler EMA'a maruz kalan + Melatonin alan grupta az olarak saptandı. Statiksel sonuçların değerlendirmesinde EMA'a maruz kalan + Melatonin verilen grup ile EMA'a maruz kalan grubun arasında tamamen anne ratlarda ve kısmen yavru ratlarda belirgin bir fark olduğu bulundu. Sonuç olarak EMA'a bağlı oluşan hasara karşı melatonin'in antioksidan etkisinin, tiroid bezi üzerinde koruyucu etkiye sahip olduğunu düşünmekteyiz.Anahtar kelime: Elektromanyetik Alan, Tiroid bez, Melatonin, İmmunhistokimya
Farelerde gebelik boyunca FKBP52 ile PRDX6 arasındaki etkileşimler
Bir immünofilin olan FK506'ya bağlanan protein 52 (FKBP52), steroid hormon reseptör aktivitesini değiştiren bir Hsp90 koşaperonudur. FKBP52'nin reseptör-şaperon kompleksleri ile işbirliği sonucu reseptörün hormona bağlanması artar. Daha önce yapılan çalışmalarda CD1 ve C57BL6/129 genetik zeminli Fkbp52 geni çıkarılmış (Fkbp52-/-) dişi farelerde ovulasyon ve fertilizasyonun normal olduğu ancak implantasyonun gerçekleşmediği gözlenmiştir. Fkbp52-/- dişi farelere gebeliklerinin 2-4. günleri boyunca Progesteron (P4) enjeksiyonu yapıldığında CD1 genetik zeminli olanlarda implantasyon gerçekleşmekte ancak C57BL6/129 genetik zeminli olanlarda gerçekleşmemektedir.P4 enjeksiyonu yapılan CD1 genetik zeminli Fkbp52-/- farelerde implantasyon gerçekleşmesine karşın C57BL6/129 genetik zeminli olanlarda gerçekleşmemesi, CD1 Fkbp52-/- farelerde gebeliğin terme ulaşabilmesi için daha fazla P4 düzeylerine gereksinim duyulması, plasentada Fkbp52 eksprese edilmesine karşın Pgr'nin eksprese edilmemesi bilgilerinden yola çıkarak FKBP52'nin steroid hormon P4'ün reseptörü olan Progesteron reseptörü (PR) aktivitesini optimize etmekten başka bir fonksiyonu olabileceği hipotezini kurduk.Yaptığımız 2 boyutlu ayrım jel elektroforezi ve kütle spektrometresi sonucunda Fkbp52-/- uterusta P4-PR sinyalinden bağımsız olarak sadece antioksidan protein Peroksiredoksin6 (PRDX6)'nın azaldığını bulduk. Bu proteinin spesifik olarak uterusta azaldığını Northern Blot yöntemi ile gösterdik. Ayrıca 8-izoprostan assay oksidatif stresin uterusa spesifik olduğunu gösterdik.Normalde implantasyonun %100 oranında gerçekleştiği P4 uygulanan Fkbp52-/- farelere oksidatif stres indükleyici ajan parakuat enjeksiyonu bu fareleri oksidatif strese daha hassas hale getirerek implantasyonu büyük ölçüde inhibe etti. Bu farelere parakuatın yanı sıra N-Asetil sistein ve ?-Tokoferol antioksidanlarının uygulanması bu farelerdeki implantasyon başarısını artırdı.Desiduada FKBP52 ile PRDX6 arasında fiziksel etkileşim olduğunu immünopresipitasyon yöntemiyle gösterdik.Fkbp52-/- fareler ile in vivoda elde ettiğimiz bulguları in vitroda fare embriyonik fibroblast çalışmaları ile doğruladık.Elektron mikroskopi incelemeleri ile Fkbp52-/- farelerin uterusunda vahşi tip uterusa oranla ultrastrüktürel düzeyde değişiklikler olduğunu gösterdik.Çalışmamız, FKBP52'nin PR kompleksindeki koşaperon fonksiyonunun yanı sıra uterusta PRDX6 ile etkileşip oksidan/antioksidan düzeylerini etkileyerek gebeliği oksidatif stresten koruduğunu göstermiştir.
Rapamisin uygulamasının fare spermatogenik hücrelere etkisi
Spermatogenez, hücre yenilenmesi ve farklılaşmasını içeren karmaşık bir süreçtir. Rapamisinin memeli hedefi (Mammalian target of rapamycin/mTOR) sinyal yolağı; hücre metabolizması, büyümesi ve kurtuluşunda merkezi bir düzenleyicidir. mTOR, çeşitli proteinler ile fiziksel ilişki kurarak, mTORC1(mTOR kompleks 1) ve mTORC2 (mTOR kompleks 2) protein komplekslerini oluşturur. mTOR inhibitörü rapamisine duyarlı olan mTORC1, hücre büyümesi için gerekli olan protein sentezini ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E)-bağlanma proteini 1 (4E-BP1) ve p70 ribozomal S6 Kinaz 1 (p70S6K1)'i fosforlayarak tetikler. Tüberoz Skleroz Kompleks (TSC2/Tuberin), mTOR aktivitesini negatif yönde düzenleyen bir tümör baskılayıcıdır. mTOR inhibitörleri, organ transplantasyonu hastalarında bağışıklık sistemini baskılamak için kullanılan ilaçlardır. Son yıllardaki raporlar rapamisinin, organ nakli hastalarında kullanılmasının testosteron düzeylerinde ve sperm sayılarında düşüşe neden olarak, fertiliteyi olumsuz etkilediğini ortaya koymaktadır. Rapamisin ve ilişkili mTOR sinyal yolağının sperm üretimi üzerine olan bu etkiyi ne şekilde gerçekleştirdiği hakkında literatürde bilgi oldukça eksiktir. Bu noktadan yola çıkarak birinci aşamada mTOR sinyal yolağı ile ilişkili proteinlerin erişkin fare testisinde esasen erken spermatogenik seri hücrelerinde ekspre olduğunu gösterdik. İkinci aşamada bu yolağın testiste ne şekilde rolü olabileceğini araştırmayı hedefledik. Çalışmada erişkin erkek farelerden kontrol, taşıyıcı ve rapamisin olarak 3 grup oluşturulmuştur. Farelerin testisinden elde edilen seminifer tübüller 24 saat seminifer tübül damla kültüründe kültüre edilmiştir. Rapamisin grubu 200 nmol rapamisin varlığında, taşıyıcı grubu etanol (rapamisin çözücüsü) varlığında kültüre edilirken, kontrol grubu %0,1 lik BSA içeren RPMI medyumu içerisinde kültüre edilmiştir. Kültür sonrası tüm gruplar için canlılık testi yapılmıştır. mTOR sinyal yolağı inhibisyonunun belirteci olan fosforile S6K, hücre bölünme belirteçleri olan PCNA, mayoz bölünmelere girişin belirteci olan Stra8 ve bir başka mayoz bölünme belirteci olan sycp3, germ hücre belirteci olan VASA ve mTOR sinyal yolağı ilişkili proteinlerinin ekspresyonları western blot tekniği ve immünohistokimya teknikleri ile gösterilmiştir. Tüm gruplara TUNEL metodu uygulanarak hücre ölümü değerlendirilmiştir. Tüm proteinlerin genlerinin mRNA düzeyleri, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile belirlenmiştir. Tüm gruplarda hücre canlılıklarının eşit olduğu gözlenmiştir. Rapamisin grubunda kontrole oranla p-S6K, PCNA ve Stra8 ekspresyonlarının anlamlı derecede azaldığı gözlenmiştir. VASA ekspresyonunun tüm gruplarda eşit olduğu gösterilmiştir. Apoptoza uğrayan hücre sayılarında gruplar arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir. 4EBP1 seviyesinin rapamisin grubunda azaldığı gözlendi. VASA ve PCNA genlerinin mRNA seviyelerinin rapamisin uygulanan gruplarda diğer gruplara göre anlamlı bir şekilde arttığı gözlenmiştir. Çalışmamız mTOR sinyal yolağının spermatogonyal kök hücrelerin proliferasyonu ve mayoz bölünmeye girerek farklanmasında rolü olabileceğini gösteren ilk fonksiyonel çalışmadır. Bu çalışma mTOR sinyal yolağının erkek üreme sistemindeki rolüne ek olarak ileride yapılacak olan kök hücre çalışmaları için ışık tutabilecek bulguları ortaya koymuştur.
Normal ve diyabetik insan plasentalarinda syncytin proteninin dağilimi ve muhtemel görevleri
İnsan plasentası, gebelik boyunca anne ile fetüs arasıdaki tüm metabolizma işlemlerini düzenleyen yegâne organdır. Bu nedenle sağlıklı bir gebelik normal plasenta gelişimi ile yakından ilişkilidir. Şimdiye kadar yapılan çalışmalar, sitotrofoblast hücreleri arasında meydana gelen hücre füzyonunun sinsisyotrofoblastın şekillenmesinde anahtar rol oynadığını göstermektedir. İnsan endojen retrovirus ailesine (HERV) ait Syncytin proteinlerinin trofoblast hücre füzyonu ve dolayısıyla plasenta gelişiminde kritik rol oynadığı yakın tarihli çalışmalarda gösterilmiştir. Fakat gestasyonel diyabetik plasenta patolojisinde Syncytin proteinlerinin ve reseptörlerinin rolünün olup olmadığı hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle çalışmamızda, kontrol plasenta ve gestasyonel diyabetik plasentalarda Syncytin proteinleri ve reseptörleri farklı ekspresyonlar gösterir hipotezini kurduk ve değişen Syncytin-reseptör ekspresyonlarını belirlemeyi amaçladık. Çalışmamızda, insan normal term ve gestasyonel diyabetik term gebeliklerinden elde edilen plasenta dokuları ile erken dönem plasenta örnekleri ışık mikroskobu, western blot ve elektron mikroskobu araştırmaları için hazırlandı. Plasenta kesitlerinde; Syncytin 1, Syncytin 2, SLC1A5 (Syncytin 1?in reseptörü) ve MFSD2 (Syncytin 2?nin reseptörü) için immünohistokimya yöntemi uygulanarak bu proteinlerin hücresel dağılımları belirlendi. Western blot tekniği kullanılarak Syncytin 1, Syncytin 2, SLC1A5 ve MFSD2 ekspresyon miktarları protein düzeyinde araştırıldı. Ayrıca, geçirimli (TEM) ve taramalı (SEM) elektron mikroskobu yöntemleri ile insan normal term, gestasyonel diyabetik term ve erken dönem plasenta örnekleri arasındaki ince yapı ve üç boyutlu yapı farklılıkları incelendi. Elde ettiğimiz bulgulara göre, Syncytin 1, Syncytin 2, SLC1A5 ve MFSD2 proteinlerinin lokalizasyonu villusların trofoblast tabakasında belirgin bir şekilde izlenirken, villusların stromasında bulunan bazı hücrelerde de immün pozitifti. Farklı gebelik dönemlerine ait plasentalarda Syncytin proteinleri ve reseptörlerinin ekspresyon düzeyleri karşılaştırıldığında; Gruplar arasında Syncytin 1 proteini bakımından anlamlı bir fark belirlenmezken, SLC1A5 protein ekspresyonunun erken dönem plasenta örneklerinde term plasentalara kıyasla daha fazla olduğu belirlendi. Ayrıca, diyabetik plasentalarda, normal term plasentalara kıyasla azalan Syncytin 2 ve MSFD2 ekspresyonu belirlendi. Elektron mikroskop bulgularımıza göre, sinsisyotrofoblast tabakasında, diyabetik plasentalarda yapı bütünlüğünün kontrol plasentalara göre göreceli olarak bozulduğu ve ince yapılarının göreceli olarak arttığı görüldü. Çalışmamız, gestasyonel diyabetik plasentalarda Syncytin protein ve reseptör ekspresyonlarının belirlendiği literatürdeki ilk çalışmadır. Gestasyonel diyabetik plasentalardaki azalan Syncytin 2 ve reseptör ekspresyonu anormal sinsisyotrofoblast oluşumuna neden olarak diyabetik plasenta patolojisinin oluşmasında rol oynuyor olabilir. Diyabetik plasentalarda görülen anormal Syncytin 2 ve reseptör ekspresyonu diyabetik plasenta etiyolojisini anlamak için katkıda bulunabilir. Anahtar Kelimeler: İnsan plasentası, gestasyonel diyabet, syncytin 1, syncytin 2, SLC1A5, MFSD2.
Characterization of EPABP [embryonic poly(a) binding protein] and pabpc1 [poly(A) binding protein, cytoplasmic 1] expression in testis
ePABP (embryonic poly(A) binding protein), functions in translational regulation of the maternal mRNAs stored during oocyte development. In the early embryos after embryonic genome activation and in the somatic cells, translational control of the mRNAs is carried out by PABPC1 (poly(A) binding protein, cytoplasmic 1). In mammalians, transcription ceases at midspermiogenesis stage of spermatogenesis. In this study, we aimed to characterize expressional levels and cellular localizations of the ePABP and PABPC1 mRNAs in the postnatal mouse testes and isolated spermatogenic cells. For this purpose, testes were obtained from C57BL/6male mice at different ages of postnatal development (D6, D8, D16, D20, D29, D32 and D88). ePABP and PABPC1 gene expression in the dissected testes and isolated spermatogenic cells were detected by qRT-PCR. Also, cellular localization of the ePABP mRNA by using RNA in situ hybridization was revealed in the postnatal mouse testes. As a result of this study, ePABP gene expression was found to be very low levels at D6, D8, D16 and D20 testes; it began to increase at D29 and reached the highest level at D32. While PABPC1 expression at D6 and D8 testes was observed at low levels, it started to increase at D16 and reached the highest level at D32. ePABP gene expression in the spermatogonia, spermatocytes and round spermatids derived from D32 testis was determined higher than other days. Similar to ePABP findings, PABPC1 expression in the spermatogonia, spermatocytes and round spermatids was higher than other days. It was found that ePABP mRNA was localized to only in the seminiferous tubules and exhibited cytoplasmic localizations in the spermatogenic cells of the seminiferous tubules. Also, ePABP mRNA was demonstrated to be higher particularly in the spermatogonia at D29, D32 and D88 testes. These results show that ePABP and PABPC1 genes may function in translational control of the mRNAs transcribed during mouse spermatogenesis.
Pereimplantif dönem fare embriyo gelişiminde p38 MAPK aracılı GLUT ekspresyonunun değerlendirilmesi
Fertilizasyon ile implantasyon arasında geçen yaklaşık bir haftalık süre preimplantasyon gelişim dönemi olarak tanımlanır. Bu dönemde meydana gelebilecek herhangi bir anormallik, embriyonun gelişim potansiyelini ve/veya yaşayabilirliğini etkileyebilmektedir. Glukoz preimplantasyon embriyolarda 8-hücreli embriyo aşamasından önce kullanılmazken, kompaksiyonun gerçekleşmesinden itibaren embriyo gelişimini destekleyen temel enerji kaynağıdır. Preimplantasyon embriyolarda glukoz transportu, ?kolaylaştırıcı glukoz taşıyıcıları? olarak bilinen GLUT proteinleri aracılığı ile gerçekleştirilir. GLUT proteinleri, preimplantasyon embriyoların değişen çevresel koşullara ve metabolik ihtiyaçlara adaptasyon yeteneğini sağlamaktadırlar. p38 MAPK (mitojenle-aktive edilen protein kinaz) sinyal yolağı çok sayıda önemli hücresel aktivitede rol oynamaktadır. Yapılan çalışmalarda, p38 MAPK sinyalinin farmakolojik inhibitörü olan Sitokin Baskılayıcı Anti-İnflamatuar İlaçlar (CSAIDs) kullanılarak p38 MAPK aktivitesinin inhibe edilmesinin, preimplantif gelişimi yavaşlattığı gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda, p38 MAPK sinyali ile GLUT ekspresyonu arasında bir ilişki olduğu da farklı somatik hücre hatlarında ortaya konulmuştur. Bu bulgular, p38 MAPK yolağının preimplantasyon embriyolarda da glukoz metabolizması ile ilişkili bir mekanizma olabileceğini akla getirmektedir. Çalışmada 5-6 haftalık dişi farelerden (Balb/C) toplanan 2-hücreli embriyolardan kontrol, çözgen (inhibitör çözücüsünün verildiği) ve inhibitör (20 µM SB203580 verilen) olarak üç grup oluşturulmuştur. İn vitro kültür süresince embriyoların gelişim potansiyelleri takip edildi ve kontrol grubundaki yarıklanma süresi esas alınarak karşılaştırıldı. Bu üç gruptan in vitro ortamda elde edilen 8-hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolarda GLUT1 ve GLUT4 ekpresyon düzeyleri belirlendi. GLUT1 ve GLUT4 proteinlerinin kalitatif değerlendirmeleri immünfloresan yöntemiyle; bu genlerin mRNA ekspresyonları ise qRT-PCR (kantitatif real time PCR) yöntemi ile belirlendi. Çalışmamızın sonuçlarına göre, p38 MAPK sinyal aktivitesinin preimplantasyon gelişiminin devamı için gerekli mekanizmalardan biri olduğu görülmektedir. Hücre içerisindeki p38 MAPK sinyal aktivitesinin durdurulmasına bağlı olarak, GLUT1 protein ekspresyonu morula ve blastosist evresi embriyolarda; GLUT4 protein ekspresyonu blastosist evresi embriyolarda belirgin düzeyde azalmaktadır. Ayrıca, p38 MAPK inhibisyonunda blastosistlerde Glut1 ve Glut4 mRNA ekspresyon düzeyinde artış gözlenmiş, fakat bu artış anlamlı bulunmamıştır. Sonuç olarak, preimplantasyon dönem embriyolardaki p38 MAPK sinyali, GLUT1 ve GLUT4 protein ekspresyonlarının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Çalışmamız, preimplantasyon gelişimi düzenleyen hücre içi mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.
Fare preimplantif embriyo gelişim sürecinde FOXO1, FOXO3 ve FOXO4 ekspresyonlarının değerlendirilmesi
Embriyo fallop tüplerinden uterusa doğru yol alırken implantasyona hazırlanır ve endometriyuma implante olana kadar geçirdiği süreç preimplantasyon dönem embriyo gelişimi olarak tanımlanır. Preimplantif dönemdeki embriyo, yarıklanma bölünmelerine başladığında; 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyoyu oluşur. Preimplantif embriyo gelişim süreci, maternal çevrede bulunan büyüme faktörleri tarafından üretilen sinyallere bağlı olarak pek çok farklı hücresel olay tarafından etkilenmektedir. PI3K/Akt sinyal yolağı, büyümeyi ve gelişmeyi destekleyen pek çok sinyal yolağından birisidir. FoxO transkripsiyon faktörleri, nükleusta görev yaparlar ve aktiviteleri PI3K/Akt sinyal yolağı tarafından düzenlenir. Memelilerde, FoxO1, FoxO3a, FoxO4 ve FoxO6 olmak üzere dört adet FoxO ailesi üyesi tanımlanmıştır. FoxO'lar; glikoz metabolizması, enerji homeostazı, hücresel farklanma, oksidatif strese karşı dayanıklılık, hücre siklusunun duraklaması, DNA tamiri ve apoptozun düzenlenmesi, gibi süreçlerde önemli roller oynarlar. Büyüme faktörleri varlığında sitoplazmada lokalize olan FoxO'lar, oksidatif stres ya da genotoksik stres gibi koşullarda nükleusa göç ederler ve hedef genlerin transkripsiyonunu sağlarlar. FoxO moleküllerinin dişi ve erkek üreme sisteminde ve fertilitenin korunup devamlılığının sağlanmasındaki önemli rolleri ve FoxO transkripsiyon faktörlerini düzenleyen PI3K/Akt sinyal yolağının, oosit matürasyonunda ve preimplantif embriyo gelişim sürecinde varlığı yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir. Tüm bu bilgiler, bir yandan çoğalırken diğer yandan farklanan ve mikroçevresi sürekli değişirken ortama adapte olmaya çalışan preimplantif gelişim sürecindeki embriyoda, FoxO transkripsiyon faktörlerinin de ekspre olabileceği sorusunu akla getirmektedir. Bu çalışmanın amacı, preimplantasyon embriyo gelişim sürecinde FoxO transkripsiyon faktörlerinin ekspre olup olmadığının, eğer oluyor ise hücredeki lokalizasyonlarının belirlenmesidir. Çalışmamızda 5-6 haftalık Balb/C ırkı dişi fareler kullanılarak hormonal indüksiyon (PMSG ve hCG) ile; profaz I, metafaz I ve metafaz II evresindeki oositler ve erişkin Balb/C ırkı erkek fareler ile çiftleşme sonucunda elde edilen 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolar fallop tüpleri ve uteruslarından toplanmıştır. İmmünfloresan yöntemi kullanılarak; FoxO1, FoxO3 ve FoxO4 proteinlerinin ekspresyonları ve lokalizasyonları ortaya konmuştur. Çalışmamız; profaz I, metafaz I ve metafaz II oositlerinde ve 1 hücreli, 2 hücreli, 4 hücreli, 8 hücreli, morula ve blastosist aşamasındaki embriyolarda, FoxO1, FoxO3 ve FoxO4 proteinlerinin farklı düzeylerde ekspre edildiğini gösteren literatürdeki ilk çalışmadır. Sonuçlarımız, in vivo embriyo gelişimi sürecinde sitoplazmada ekspre olduğu belirlenen FoxO transkripsiyon faktörlerinin özellikle in vitro embriyo gelişimi sırasında veya stres koşullarında (pH, oksijen düzeyi, ısı değişimleri gibi) ekspresyonlarının ne şekilde olabileceği ile ilgili yapılabilecek çalışmalar için temel oluşturmuştur. Özellikle yardımcı üreme tekniklerinde embriyo gelişim süreçlerinde FoxO transkripsiyon faktörlerinin araştırılması ile ilgili ileri çalışmalar laboratuvarımızda devam etmektedir.
Metastatik ve non metastatik tümörlerde nefronektin ekspresyonu
Meme kanseri kadınlarda sıkça görülen ve tedavi edilmezse ölüme sebebiyet verebilen bir kanser türüdür. Meme kanseri metastaz yapma yeteneği sebebiyle tehlikeli bir hastalıktır. Metastaz; tümörün bulunduğu yerden ayrılıp başka bir organda yeni bir tümör oluşturmasıdır. Metastazın gerçekleşebilmesi için tümör önce bulunduğu dokuda büyüyüp gelişmeli daha sonra da damarlar yardımıyla uzak organlara göç etmelidir. Tümör metastazı sırasında yeni gideceği çevredeki normal yapıyı bozarak kendine bir ortam yaratmalıdır. Bu yeniden düzenlenmede de hücre dışı matriks proteinleri de görevalmaktadır. Nefronektin; epiteliyal mezenkimal geçişte rol oynadığı bilinen bir hücre dışı matriks proteinidir. Tümör gelişiminde rol alabileceği düşünülen nefronektinin metastatik tümörler üzerindeki etkisini gösteren bir çalışma henüz yapılmamıştır. Bu nedenle çalışmamızda metastatik ve metastatik olmayan hücre hatlarını kullanarak oluşturulan primer tümörlerde ve metastaz alanlarında nefronektin ekspresyonunu değerlendirmeyi amaçladık. Çalışmamızda metastatik olduğu bilinen 4TLM ve 4THM; ve metastatik karakterde olmayan 67NR hücre hatları enjekte edilen farelerden 12. ve 25. günlerde alınan pimer tümör, akciğer ve karaciğer dokuları, ışık mikroskobu ve western blot araştırmaları için hazırlandı. Elde edilen kesitlerde nefronektin ve Ki67 proteinleri için immünohistokimya metodu uygulanarak bu proteinlerin dokulardaki dağılımları belirlendi. Western blot tekniği kullanılarak da nefronektin ve Ki67 ekspresyon miktarları protein düzeyinde araştırıldı. Bulgularımıza göre; nefronektin ekspresyonunun primer tümör, akciğer ve karaciğerlerde, metastazın yoğunluğuna bağlı olarak azaldığı gözlendi. Ayrıca metastazın ileri evresi olan 25. günde, metastazın henüz gerçekleşmediği 12. güne göre nefronektin ekspresyonunda bir azalma olduğu görüldü. Proliferasyon belirteci olan Ki67'nin; metastatik hücre hatlarından alınan dokularda yoğun olarak lokalize olduğu; ayrıca metastatik olmayan hücre hattından alınan dokularda da yoğun olmasa da varlığı belirlendi. Çalışmamız; metastatik yetenekteki hücre hatlarından elde edilen primer tümör, akciğer ve karaciğer dokularında nefronektin ekspresyon değişimini gösteren literatürdeki ilk çalışmadır. Elde edilen bulgular; hücrelerin dokuya invaze olabilmeleri ve hücre dışı matriks düzenini değiştirerek metastaz yapabilmelerinde nefronektin proteininin bağlantı noktalarında ayrılmaları sebebiyle ekspresyonunun düştüğü ve hücre dışı matriksdeki yerleşiminin bozulduğu ihtimalini düşündürmektedir. Özellikle metastazın yoğun olduğu alanlarda ekspresyonunun düşmesi bu proteinin metastatik süreçte görevli olma ihtimalini akla getirmektedir.
İnsan eklem kıkırdağından kondrosit ve kondroprojenitör/kök hücre izolasyonu, kültürü, bu iki hücre hattının kondrogenez kapasitesi yönünden karşılaştırılması
Eklem kıkırdağı ile ilgili yapılan kök hücre çalışmalarında, yetişkin eklem kıkırdağında projenitör/kök hücre özelliğine sahip hücrelerin mevcut olabileceğini ve bu hücrelerin bazı teknikler kullanılarak izolasyonlarının gerçekleştirilebileceği belirtilmektedir. Bu nedenle çalışmamızda, erişkin insan femuru distal eklem kıkırdağından kondrosit ve projenitör/kök hücre izolasyonu ve kültürlerinin yapılmasının ardından, in vitro ortamda, kök hücre belirteci ekspresyonlarının, farklı dokulara yönlenebilme kapasitelerinin ve ultrastrüktürel yapılarının araştırılması amaçlandı. Çalışmamızda, erişkin insan eklem kıkırdağı örneklerinden pronaz/kollagenaz sindirimi ile kondrositlerin izolasyonu gerçekleştirildi. Tam kat kondrositlerin kültür ortamında çoğalmasına izin verilirken, projenitör/kök hücre özelliğini taşıdığını düşündüğümüz hücrelerin fibronektin adhezyon testini takiben koloniler seçilerek planlanan parametrelerin uygulanabilmesi için kültürasyonlarına devam edildi. Çalışmada incelenen parametreleri özetlemek gerekirse; kültürü yapılan kondrosit ve koloni hücre süspansiyonlarında, CD90, STRO-1, CD105, CD166 gibi kök hücre belirteci expresyonlarının immunohistokimyasal ve flow sitometrik yöntemle belirlenmesi, kondrosit ve koloni kültür hücrelerinin kondrogenez, adipogenez ve osteogenez'e yönlendirilmesi, bu iki hücre hattına ait hücrelerin ultrastrüktürel yapılarının araştırılması parametreleri gerçekleştirilmiştir. Çalışmada elde ettiğimiz bulgular şöyle özetlenebilir; kondrosit ve koloni kültür hatları flow sitometrik yöntemler ile karşılaştırıldığında, CD90, STRO-1, CD105 ve CD166 ekspresyon düzeylerinin benzer olduğu belirlendi. Kondrosit ve koloni kültür hücreleri uzun süreli kültürasyon sonrasında immunohistokimyasal olarak incelendiğinde, her iki grup hücrenin de bu belirteçlerin tümünü eksprese ettikleri, bununla birlikte koloni kültür hücrelerinde immunoboyanma yoğunluğunun daha fazla olduğu gözlemlendi. Yönlendirme deneylerinde, koloni hücrelerinin adipogenez ve osteogenez sürecinde, primer hücrelerin ise kondrogenez sürecinde daha iyi sonuçlar verdiği belirlendi. Bu iki hücre hattının ince yapıları incelendiğinde, koloni hücrelerinin kondrositlere göre daha bol miktarda genişlemiş granüllü endoplazmik retikulum (GER) ve ribozom, daha az miktarda da lizozom içerdiği tesbit edildi. Sonuç olarak, bu çalışmada elde edilen bulgulardan yola çıkılarak, erişkin insan eklem kıkırdağında mevcut olan progenitor/kök hücrelerin mezenkimal kök hücre (MKH) özelliği taşıyabileceği söylenebilir. Ayrıca, kondrosit kültür hücrelerinin de uzun süreli kültürasyonu takiben MKH özelliğine yakın karakterler kazanabileceği de belirtilebilir.
Gebe sıçanlarda valproik asit kullanımının fetüste neden olduğu merkezi sinir sistemi hasarına kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrenin etkisi
Epilepsi; kortikal nöronlardaki anormal ve aşırı elektriksel deşarj sonucu ortaya çıkan, ani ve tekrarlayıcı tanımlanabilen bir olayla tetiklenmemiş nöbetlerle karakterize bir hastalıktır. Epilepsi hastalığı tüm dünyada yaygın bir şekilde görülür. Hiçbir etnik fark, cinsiyet ayrımı, yaş sınırı ve sosyal sınıf tanımayıp, dünyada 50 milyon insanı etkilediği tahmin edilmektedir. Epilepsi tedavisinde çeşitli antiepileptik ilaçlar kullanılmaktadır. Bunlardan bazıları benzodiazepin, GABA (Gama aminobütirik asit) analogları ve hormonlardır. Epilepsi tedavisinde kullanılan diğer bir antiepileptik ilaç valproik asittir. Ancak valproik asitin gebelikte kullanılımı çok önemli yan etkilere neden olmaktadır. En önemli yan etkileri; spina bifida, myelomeningosel gibi nöral tüp defektleri, kol ve bacak malformasyonları, dudak yarığı, kardiyovasküler malformasyonlar ve fasiyel dismorfizimdir. Bu verilerden yola çıkarak bu çalışmada gebe sıçanlarda valproik asitin kullanımına bağlı olarak fetüste oluşabilecek nöral tüp defektlerine ve/veya diğer konjenital malformasyonlara, merkezi sinir sistemi hasarına kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin etkinliğini araştırmayı hedefledik. Çalışmamızda 24 erişkin "Wistar Albino" dişi sıçan gebeliklerinin 9. günlerinde deney ve kontrol olmak üzere 2 farklı gruba ayrıldı. Deney grubundaki gebeliklerinin 9. gününde olan 16 sıçanın 8'ine subkutan yolla valproik asit (VPA) enjekte edilirken diğer 8'ine ise hem VPA (subkutanöz) hem de sıçan kemik iliğinden elde ettiğimiz mezenkimal kök hücreler aynı gün kuyruk veninden enjekte edildi. Kontrol grubunda olan 8 sıçana ise gebeliklerinin 9. gününde kuyruk veninden Phosphate Buffered Saline (PBS) verildi. Çalışmaya dahil edilen 24 adet "Wistar Albino" cinsi gebe sıçandan gebeliklerinin 21. gününde alınan fetüslerin beyin ve omurilikleri çıkarıldı. Tespit edildikten sonra bu dokular Hematoksilen&Eozin ve Toluidin Blue O boyaları ile histokimyasal; S100b ile immunohistokimyasal olarak incelendi. Anahtar Kelimeler: Epilepsi, Valproik asit, Nöral Tüp Defekti, Mezenkimal Kök Hücre, S100b.
Farelerde embriyolojik gelişim sürecinde EGF (Epidermal büyüme faktörü) ve anti-egf'nin microfold (M) hücreleri üzerindeki etkisi
Mikrokatlantı hücreleri (M hücreler) mukozal lenfoid folikülleri çevreleyen folikül ilişkili epitelde yer alan mukozal immun yanıtı başlatan özelleşmiş epitelyal hücrelerdir. M hücreler luminal antijenleri alarak mukoza altında yer alan mukoza ilişkili lenfoid dokulara (MALT) bu antijenleri sunmaktadırlar. Epidermal büyüme faktörü, hücrelerin bölünmesi, farklılaşması, yaşaması, çoğalması, büyümesi ve hücre göçünü uyaran protein yapıda bir büyüme faktörü olup, organizmadaki pek çok fizyolojik ve patolojik süreçte rol almaktadır. EGF, anti-enflamatuar, anti-apoptotik, nörotrofik ve nöroprotektif etkilere sahiptir. Bu çalışmada M hücrelerinin embriyolojik gelişim sürecinde EGF (Epidermal Büyüme Faktörü) ve Anti-EGF olarak EGF reseptör blokeri olan bir monoklonal antikor'un etkilerinin tespit edilmesi amaçlandı. Kontrol grubu, EGF verilen grup, EGF reseptörleri bloklanan 3 grup altında olmak üzere fetal gelişimin 13.5, 15.5, 17.5 günlerindeki fetusların bağırsakların immunohistokimyasal ve histokimyasal olarak değerlendirildi. Yapılan deney sonuçlarına göre, kontrol ve anti-EGF gruplarına kıyasla EGF verilen gruptaki mikrokatlantı hücrelerinin daha erken geliştiği ve belirteçleri açısından değerlendirildiğinde düzeylerinde artış olduğu gözlemlendi. Bu çalışmanın sonuçlar ışığında ileri zamandaki multidisipliner çalışmalar için yardımcı ve yol gösterici olacaktır.
Gebe farelerde steroid ile indüklenmiş prenatal stres kaynaklı fetal beyin gelişim hasarında centella asiatica'nın etkisinin incelenmesi
Gebelik süresince yavrunun maruz kaldığı stres faktörleri, prenatal stres olarak tariflenmekte ve çocuklukta ve yetişkinlikte karşılaşılan psikososyal problemlerin nedeni olarak karşımıza çıkmaktadır. Bilişsel davranışsal, fiziksel ve duygusal problemler ve otizmle, prenatal stresin ilişkisini açıklayan çokça araştırma mevcuttur. Farklı hayvan türlerinde yapılan in vivo çalışmalarda, deksametazon veya betametazon formundaki sentetik glukokortikoid tedavisinin maternal uygulanmasının, fetal nöronal hücre çoğalmasını azalttığını ve yavruların hipokampus dentat girus ve neokorteksindeki nörojenezi inhibe ettiğini gösterilmiştir. Geleneksel Asya tıbbında, yüzyıllardır birçok hastalığın tedavisinde kullanılan Centella Asiatica, Apiaceae ailesinden olan otsu ve çok yıllık bir bitkidir. Modern tıpta da özellikle cilt hastalıklarında, uzun süredir kullanılmaktadır. Yara ve yanık tedavisinde, sedef, egzema, keloid, hipertrofik skar gibi cilt hastalıklarında etkili olduğunu öne süren bilimsel araştırmalar mevcuttur. Son yıllarda yapılan bilimsel çalışmalarda Centella Asiatica'nın, cilt dışında, özellikle santral sinir sisteminde de önemli etkilerinin olduğunu öne sürmektedir. Centella Asiatica'nın nöroprotektif, anksiyolitik, antikonvülzan, nörojenik, sinaps artırıcı etkilerinin olduğu ve bu yolla Alzheimer, Parkinson, Huntington hastalığı, inme gibi durumların tedavisinde faydalı olabileceğine dair görüşler öne sürülmektedir. Çalışmamızda, gebe farelerde intraperitoneal kortizon uygulanarak prenatal stres ortamı taklit edilmiş olup, oluşan fetal beyin gelişim hasarında, oral Centella Asiatica uygulamasının etkileri incelenmiştir. Çalışmamızda, 18 adet dişi ve 9 adet erkek Balb/c cinsi fare kullanılmış ve gebelik oluşması sağlanmıştır. Fareler kontrol (n=6), deney (n=6) ve tedavi grubu (n=6) olmak üzere üç gruba ayrılmıştır. Gebeliğin 9-15. günleri arasında toplam 5 gün, kontrol grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün Serum Fizyolojik (SF); deney grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün deksametazon; tedavi grubuna intraperoitoneal yolla 1mg/kg/gün deksametazon ile birlikte oral gavaj yoluyla 1mL/kg/gün Centella Asiatica verilmiştir. 18,5. günde gebelikler sonlandırılarak, embriyo beyinleri diseke edilmiş ve formaldehitte tespit edilmiştir. Fetus boyları (cm) ve fetal beyinlerin en (cm), boy (cm) ve ağırlıkları ölçülmüş, kayıt altına alınmıştır. İnceleme için, hematoksilen-eozin boyama, krezil viyole boyama ve immünohistokimyasal boyama (Cas3 ve Lc3ß) yapılmıştır. Çalışmamızda, gebe farelere uygulanan deksametazonun, fetus beyinlerinin en, boy ve ağırlık değerlerinde anlamlı azalmaya neden olduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, deksametazonla birlikte Centella Asiatica uyguladığımız tedavi grubunda, fetus beyin ölçümlerinin, kontrol grubuna benzer olduğu görülmüştür. Centella Asiatica'nın apopitoza gidişi engellediğine dair kanıtlar mevcuttur. Bizim çalışmamızda da, Cas3 immunohistokimyasal boyamasıyla yapılan incelemelerde, Centella Asiatica uygulamasının apopitozu gidişi engellediği ve incelenen dönem içinde (kısa vade) hasar oluşumunu azalttığı gözlenmiştir. Centella Asiatica'nın otofaji üzerine de baskılayıcı etkileri öne sürülmektedir. Bizim çalışmamızda da, Lc3ß immunohistokimyasal boyama yöntemi ile, otofajinin, Centella Asiatica uygulanan tedavi grubunda, deney grubuna göre daha az olduğu gözlenmiştir.