Generation of a CRISPR/Cas based genome editing system for MEFV gene in familial mediterranean fever-specific induced pluripotent stem cells

Herhangi bir bireyden uyarılmış pluripotent kök hücre türetilebilmesi, hastaya ve hastalığa özgü hücre kültürü modellemelerinin oluşmasına olanak sağlamıştır. Bu tür modeller hastalık mekanizmalarına yönelik araştırmayı hızlandırmış, yapay koşullarda ilaç taramalarının yapılabilmesi için platform sağlamıştır. Hastalığa özgü uyarılmış pluripotent kök hücre modellemelerinin güçlüklerinden biri genetik olarak eşit kontrollerin yokluğudur. Yakın zamanda bakteriye ait edinilmiş bağışıklık sisteminin (clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated (Cas) systems) memeli hücrelerine uygulabilir kılınması yeni bir genom yazılımını türetmiş olup konak DNA'ya sekansa özgü değişimler oluşturabilmesi için basitlik ve kesinlik sağlamıştır. Bu tezde ana amaç Crispr/Cas9'a dayalı bir sistemin ateşli genetik bir hastalığın uyarılmış pluripotent kök hücre modelinde uygulanabilmesi için araçlar oluşturmak ve hastalığa neden olan aleli yabanıl tip kopyasıyla değiştirmektir. Ailesel Akdeniz Ateşi mefv genindeki mutasyonlar sonucu ortaya çıkan otozomal çekinik otoinflamatuvar bir hastalıktır. Ailesel Akdeniz Ateşi Türkiye'de yüksek bir taşıyıcı oranına sahiptir ve hastalığın en ciddi biçimi M694V homozigot mutasyonlarda görülür. Bu durumdaki bir hastadan türetilen uyarılmış pluripotent kök hücreler ve hastalığa neden olan mutasyonlar DNA dizilemesiyle gösterilmiştir. Mutasyonlu aleli hedeflemek için mefv sekansını hedefleyen M694V mutasyonu yakınında bulunan tek ve kimerik rehber RNA'ler tasarlanmıştır ve anlatım vektörlerinin içine kopyalanmıştır. Crispr/Cas9 parçalarının memeli hücrelerdeki işlevselliği yeşil floresan haberci proteini (GFP) analiziyle insan embryonal böbrek hücrelerinde doğrulanmıştır. Homolog rekombinasyonu gözlemleyebilmek için yeşil floresan haberci protein sekansı, hedeflenmiş mefv sekansı tarafından sekteye uğratılmış bir haberci vektör kullanılmıştır. Değişik homolog rekombinasyon donör vektörleri test edilmiş ve en verimli olarak linearize vekörler seçilmiştir. Daha sonra, seçilmiş rehber RNA'lerin endojen mefv lokusunu kesebilme kapasitesi DNA bazlarındaki uyumsuzluğa yönelik DNA endonükleaz analiziyle gösterilmiştir. Ancak Crispr parçalarının ve mefv geni 10. exon sekanslarını içeren onarım vektörünün hastaya özgü uyarılmış pluripotent kök hücrelerine verilmesinden sonra düzeltilmiş alel saptanamamıştır. Düzeltilmiş alelin saptanmasını kolaylaştırmak için, belirsiz mutasyonlar ve yeni restriksiyon bölgeleri taşıyan farklı bir onarım vektörü tasarlanmıştır. Tasarlanan bu donör vektör ile restriksiyon fragment length polimorfizm analizi (RFLP) yapılıp başarılı olarak düzeltilen seyrek olarak bulunan uyarılmış pluripotent kök hücre klonlarının taranması sağlanacaktır.