Alerjenik bitki lipit transfer proteininin biyoteknolojik üretimi

Alerji dünya çapında yaygın bir hastalıktır ve görülme sıklığı giderek artmaktadır. İmmün sistemi çeşitli şekillerde uyararak alerjik reaksiyonlara yol açan en önemli molekül grubu proteinlerdir. Alerjen proteinler çeşitli kaynaklardan gelmektedir. En iyi bilinen kaynaklardan biri aeroalerjen olan polenlerdir. Polenlerdeki yaygın alerjenlerin tanımlanması ve biyoteknolojik yöntemlerle üretilmesi, alerjinin moleküler mekanizmasını aydınlatmaya yönelik temel bilim çalışmaları için önemli olduğu gibi, alerji tanı ve tedavisinde de gelişmelere yol açacağından güncel araştırma konuları içinde yer almaktadır. Bitkilerdeki spesifik olmayan lipit transfer proteinlerinin (nsLTP'ler), özellikle Akdeniz ülkelerinde sıklıkla görülen polen ve gıda alerjilerine neden olduğu bilinmektedir. Polenlerde bulunan nsLTP'lerin alerjik özellikleri bitki türüne, coğrafi bölgeye ve çevresel koşullara göre değişir. Alerjenitesinin yüksek olduğu bilinen Morus alba (akdut) polenindeki nsLTP üzerine bir çalışma bugüne kadar yapılmamıştır. Bu çalışmanın temel amacı, gelecek çalışmalarda kullanmak üzere, M. alba polenindeki nsLTP'yi biyoteknolojik olarak üretmektir. Çalışmanın ilk aşamasında, M. alba polenlerinden total RNA izolasyonu yapıldı ve daha sonra RT-PZR ile cDNA kütüphanesi oluşturuldu. cDNA kütüphanesindeki nsLTP geni uygun primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı ve Sanger DNA dizileme yöntemi ile gen dizisi doğrulandı. nsLTP geni, uygun restriksiyon enzim kesim noktalarının dizilerini içeren primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı. PZR ürünü 6xHis etiketi taşıyan pQE-2 vektörüne klonlandı ve ardından Escherichia coli BL21 (DE3) hücreleri bu vektörle transforme edildi. Transformant E. coli hücreleri koloni PZR yöntemi ile seçildi. Çalışmanın ikinci aşamasında, rekombinant nsLTP proteinini bol miktarda üretmek için çalışma hacmi artırıldı ve transformant hücrelerdeki protein sentezi izopropiltiyo-β-D-galaktopiranosid (IPTG) ile indüklendi. Hücre toplama ve parçalama işlemlerinin ardından izole edilen total proteinler, histidin etiketli nsLTP'nin saflaştırılması için immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) sistemine yüklendi. İmidazol ile elüe edilen rekombinant proteinin miktarı bişinkoninik asit (BCA) yöntemiyle belirlendi. nsLTP'yi izlemek ve IgE bağlama kapasitesini, alerjenitesini M. alba polen alerjisi olan hastaların serumlarıyla Western blotlama yaparak test etmek için elektroforetik ayrımlar ve analizler yürütüldü. Sonuç olarak doğal protein gibi alerjenik özelliklere sahip, yüksek miktarda, saf rekombinant nsLTP başarıyla üretildi. Bu çalışmada elde edilmiş biyoteknolojik ürün, LTP'lerin alerji gelişimindeki rolünü daha iyi anlamak için yürütülecek ileri temel ve klinik çalışmalarda kullanılabilir. Ayrıca gelecekte, özgün alerji tanı ve tedavi stratejilerinin ve araçlarının bir parçası olabilir.