Regulatory role of aplnr signaling in migration and differentiation of mesoderm tissue and mesenchymal stem cells

Embriyonik morfogenez, embriyonun gastrulasyonu sırasında bireysel veya toplu hücre migrasyonu tarafından kontrol edilen en karmaşık hücre hareketi olayıdır. Hücreden hücreye temas ve sinyal moleküllerine yanıt olarak gastrulasyon hareketleri sırasında hücre popülasyonlarının oluşturulması ve sürdürülmesi, yalnızca vücut planının ve doku modelinin belirlenmesi için değil, aynı zamanda yetişkin doku rejenerasyonu için progenitör popülasyonların oluşturulması için de gereklidir. Pluripotent kök hücreler olarak embriyonik kök hücreler (ESC'ler), insanların erken embriyonik gelişimini, gastrulasyonunu ve yetişkin doku morfogenezini özetlemek için en uygun modeldir. Süspansiyon kültüründeki ESC agregaları olarak embriyoid cisimcikleri (EB'ler), gastrulasyon ve organize germ tabakası yapısı ve germ tabakalarının in vitro gen anlatımı paternini gösteren bölgeselleştirilmiş bir doku paternini oluşturur. Wnt sinyal yolağı, morfogenetik olayları tetikleyen ve germ tabakası oluşumuyla sonuçlanan gastrulasyon hareketlerini başlatan temel düzenleyici yolaktır. Apelin reseptörü (Aplnr), ESC'lerin arka bağırsak farklılaşması sırasında yeni bir Wnt hedef geni olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, Aplnr'nin moleküler mekanizması ve gelişim ve yetişkinlikte hücre göçü ve farklılaşma sürecindeki düzenleyici rolü belirsizliğini koruyor. Tez projemin temel amacı, gastrulasyon hareketleri, doku spesifikasyonu ve hücre kaderi kararı için çok önemli olan mezoderm dokusu ve mezenkimal kök hücrelerin (MSC'lerin) hücre göçü ve farklılaşma sürecinde Aplnr sinyalinin düzenleyici rolünü anlamaktır. yetişkin doku morfogenezinde ve yetişkin doku rejenerasyonunda. Çalışma, fare ESC (mESC) ve insan ESC (hESC) hatları kullanılarak gerçekleştirildi. Aplnr yolunu etkinleştirmek veya etkisiz hale getirmek için peptid ve küçük molekül kaynaklı Aplnr sinyal aktivasyonunun yanı sıra genetik modifikasyonlar uygulandı. Aplnr sinyal yolu bileşenlerinin aşırı gen ifadeleri hESC'ler için 3. nesil lentiviral vektör sistemi tarafından sağlandı. mESC ve hESC'lerinde Aplnr yolu bileşenlerini devre dışı bırakmak için CRISPR/Cas9 gen düzenleme tekniği kullanıldı. Aplnr sinyal yolu genlerini baskılamak için siRNA ve shRNA stratejileri kullanıldı. Genetiği değiştirilmiş bu ESC'ler, üç germ tabakası spesifikasyonu sırasında Aplnr sinyalinin kontrolü ve hücre kaderi kararı altındaki hücresel hareketleri izlemek için kullanılan üç boyutlu gastruloid modeller olan EBleri oluşturmak için kullanıldı. Mezodermal popülasyonun göçü ve MSC'lere farklılaşması, farklılaşma deneyleri ile gerçekleştirildi. Bu hücre popülasyonları, moleküler düzenleyici yolakları analiz etmek için antikor dizisi, LC/MS, mRNA ve miRNA sekanslamaları dahil olmak üzere gen ve protein ekspresyon analizlerine tabi tutuldu. Morfolojik değişikliklerin yanı sıra gen ve protein ekspresyon verileri, Aplnr sinyalinin, muhtemelen EGFR, FGF ve TGF-beta sinyal yolakları yoluyla mezoderm taahhüdünü desteklediğini ve mezoderm farklılaşması sırasında ESC'lerden türetilen EB'lerin göçünü arttırdığını ortaya koydu. mESC'den türetilen mezoderm hücrelerinin antikor dizisi ve LC/MS protein profilleme verileri, Apelin-13 uygulamasının hücre döngüsü, EGFR, FGF, Wnt ve Integrin sinyal yolu proteinlerini arttırdığını gösterdi. Ayrıca, Aplnr sinyali, MSC'lerin ESC'lerden farklılaşmasını pozitif olarak düzenler ve EGFR, TGF-beta, Wnt, PDGF ve FGF sinyal yolları gibi çeşitli yolakları düzenleyerek MSC'lerin hücre canlılığını, çoğalmasını, hayatta kalmasını, MSC özelliklerini ve farklılaşma kapasitelerini artırır. Osteojenik, kondrojenik, adipojenik, odontojenik, endotel ve miyojenik farklılaşmalar Aplnr sinyal aktivitesi ile önemli ölçüde arttırıldı. Dolayısıyla, bu çalışma aynı zamanda kişiselleştirilmiş hücre tedavisinde kullanılmak üzere ESC'lerden yüksek potansiyelli MSC'ler üretmek için önemli bir temel oluşturmaktadır.