In Silico and experimental determination of IL1β-receptor inhibitor peptides

Terapötik peptitler yüksek bağlanma ve özgül bağ kurma yeteneleri, dokunun içerisine derinlemesine girebilme, düşük toksisite ve yapısal modifikasyonlarının kolay olması özelliklerinden dolayı ilaç tasarımı için gelecek vaat eden moleküller olmuşlardır. Bir ilaç adayı molekülün pazara girebilmesi için yaklaşık 15 senelik bir araştırma ve geliştirme süreci ile birlikte 2.6 trilyon dolarlık yatırım gerekmektedir. İlaç Tasarımı ve Geliştirme sürecinde aday molekülün incelenmesi için gerekli en önemli parametrelerden birisi aday molekülün hedefe olan bağlanma derecesidir. Bağlanma derecesi, ligand ve hedef molekül arasındaki kovalent olmayan bağların güçlülük değeridir. Bu tez çalışmaları IL1β-Reseptör proteinini bloke etmek için terapötik olarak kullanılan, insanda doğal olarak bulunan IL1-Reseptör antagonist molekülü ile aynı yapıya sahip ve bir rekombinant protein olan Anakinra yerine bilgisayar ortamında peptit tasarımına odaklanmıştır. Bilgisayar ortamında hesaplamalı olarak tasarımı yaılan peptitlerin geçerliliğini göstermek amacıyla da bağlanma derecesini ölçebilecek bir metot olan yüzey plazmon rezonans deneyleri yapılmıştır. IL1-Reseptör proteininin üç boyutlu yapısı incelenerek ve kovalent olmayan bağların türü ve sayısı dikkate alınarak bu yapıdan 9 farklı peptit dizilimi tasarlanmıştır. Bu peptitlerin bağlanma derecelerini inceleyebilmek için moleküler seviyede yerleştirme (docking) çalışmaları her bir peptit için aralarındaki bağları sabit tutarak 100 kez yapılmıştır. Arg – Ile – Trp – Asp – Val – Asn – Gln dizilimine sahip Peptit C, 7.91x10-8 M değerindeki KD değeri ile tasarlanan peptitler arasında en yüksek bağlanma derecesini göstermiştir. Peptit C'nin yüksek bağlanma derecesine sahip olduğunu teyit etmek için docking çalışmaları peptidin bağlarını sabitlemeden 999 defa yapılmış ve benzer sonuç elde edilmiştir. Peptit C'nin bağlanma derecesinin yüksekliğinin tutarlılığını gösterdikten sonra yapısal kararlılığını arttırmak amacıyla peptidin amino ve karboksil grup uçlarına modifikasyon yapılması amaçlanmıştır. N- terminal modifikasyonu Phe eklenmesi sonucunu verirken C- terminal modifikasyonu da karboksil grubu ucuna Lys aminoasidi eklenmesi sonucunu vermiştir. Bu modifikasyonlar peptit ve reseptör arasındaki hidrojen bağlarını tutarak aradaki hidrofobik etkileşimleri arttırmış ve hem N- hem de C- terminalleri modifiye olmuş 9 aminoasitli peptit 0.24x10-9 M KD değeri sonucunu vermiştir. Tasarlanan peptitlerin kopma yolunu anlamak ve bağlanma derecelerini daha doğru ve gerçekçi bir ortamda incelemek amacıyla SMD simülasyonları üç peptit için de yapılmıştır. SMD sonuçlarına göre üç peptit için de bağlanma dereceleri docking çalışmalarından alınan ortalama değerlerle tutarlılık göstermektedir. SMD simülasyonlarında ortamda su bulunduğu için peptit ve reseptör moleküllerinin arasına su molekülleri girerek etkileşimler ve bağlar arasındaki mesafelerin artmasına ve bu da bazı hidrojen bağlarının ve çoğu hidrofobik etkileşimlerin kaybolmasına neden olmaktadır. Bu nedenlerden dolayı da peptitler, docking çalışmalarından alınan en iyi sonuçlar yerine ortalama değerlere yakın bağlanma dereceleri göstermektedir. Tezin 3. bölümünde bilgisayar ortamında hesaplamalı olarak tasarlanan peptitler Fmoc kimyasının kullanıldığı Katı Hal Peptit Sentezi metoduyla sentezlenmişlerdir. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi metodu da yapılan sentezi incelemek için kullanılmıştır. Modifiye olmamış peptit ilk sentezimiz olmuş olup o sentezin başarılı olduğunu göstermemize rağmen kromatografi kolonunda veya cihazın kendisinde daha sonradan oluşan bir problemden dolayı peptitlere ait standard örenklerin dahi kromatogramları elde edilememiştir. Daha sonra standard örneklerin kromatogramları başka bir cihazda aynı metodu kullanarak elde edilmiştir. Ancak TFA'nın peptidi parçalara ayırma özelliğinden dolayı bu bekleme sürecinde peptitler bozulmaya uğramış olabilir ve gelecek çalışmalara standard olarak kullandığımız peptitlerle devam edilmiştir. Son olarak, deneysel olarak peptitlerin bağlanma derecelerini ölçmek amacıyla Yüzey Plazmon Rezonans metodu kullanıldı. Biacore T200 cihazında CM5 sensör çipine amin birleştirme kimyası yoluyla IL1-Reseptör proteini yerleştirildi. Cihazın doğru çalıştığından emin olmak için IL1-β proteininin IL1-Reseptör Proteinine olan bağlanma derecesi ölçüldü ve KD değeri 2.8 nM olarak elde edildi. Literatürde de bu değerin 2.7 nM olarak elde edildiği gösterilmiştir. Peptitler için de konsantrasyona bağlılık elde edilmiş olsa da DMSO'nun hacim etkisinden dolayı bağlanma dereceleri ölçülememiştir. Peptitlerin bağlanma derecelerini ölçmek için yapılacak olan kinetik analiz deneyleri DMSO'nun hacim etkisini engellemek için çözücü doğrulama metodu kullanarak tekrar edilecektir.