Characterization of the role of CITED2 in circadian clock mechanism

Sirkadiyen ritimler, siyanobakterilerden insanlara, canlıların metabolik, davranışsal ve fizyolojik faaliyetlerini 24 saatlik dilimlerde düzenleyen biyokimyasal döngüler bütünüdür. Bu ritim aslen doğuştan gelmekte olup sıcaklık, ışık gibi çevresel faktörler ve sosyal faktörlerden de etkilenerek 24 saatte bir tekrarlayan içsel saati oluşturur. İnsanlarda sirkadiyen ritim bağışıklık sistemi, uyku ve uyanıklık hali, vücut sıcaklığı, bilişsel düzey ve hormon salgılama gibi birçok fizyolojik aktiviteyi düzenler. Memeli fizyolojisinde dokusal saatleri kimyasal ve sinirsel iletim yolakları üzerinden süprakiazmatik çekirdekte bulunan merkezi saat senkronize eder. Hücresel düzeyde moleküler saat canlılar arasında korunmuş olup, benzer mekanizmalar ile düzenlenir. Moleküler saat, memeli hücresinde transkripsiyonel-translasyonel iç içe geçmiş geri bildirim döngülerinden oluşmaktadır. Bu döngülerde görev alan dört ana saat proteinleri, BMAL1, CLOCK, CRY ve PER, negatif ve pozitif geri bildirimleri oluşturur. BMAL1 ve CLOCK ikili yapı oluşturup aktifleştirici olarak pozitif kolda yer alır, CRY ve PER protein ekspresyonunu başlatır. CRY ve PER sitoplazmada biriktikten sonra çekirdeğe lokalize olarak, BMAL1/CLOCK kompleksi üzerinde negatif etki oluşturur ve kendi ekspresyonlarının baskılanmasını sağlar. Bu sebepten CRY ve PER negatif kolda baskılayıcı olarak görev alır. Önceden yürütülen yüksek kapasiteli (high-throughput) lusiferaz tarama yöntemi ile BMAL1/CLOCK transkripsiyonu üzerinde etkili aday saat proteinleri belirlenmiştir. CITED2, bu çalışma sonunda belirlenen aday saat proteinleri arasındadır. Bu tez çalışmasını CITED2'nin saat mekanizmasındaki görevini bulmayı amaçlayarak yürüttüm. İlk olarak CITED2'nin BMAL1/CLOCK kompleksinin aktivasyonu üzerinde baskılayıcı etkiye sahip olduğunu gösterdim. Bu baskılayıcı etkinin CITED2'nin CLOCK ile bağlanması sonucunda oluştuğunu ve BMAL1/CLOCK arasındaki etkileşimi azalttığını gösterdim. CITED2 fazla üretiminin U2-OS hücre hattında sirkadiyen saat periyodunu uzattığını ve genliğini artırdığını gösterdim. Moleküler boyutta, CITED2'nin fazla üretildiği hücre hattında DBP ve PER seviyelerinin azalışını, bunu destekleyecek şekilde, CITED2'nin az üretildiği hücre hattında DBP ve PER2 mRNA seviyelerinin artışını gözlemledim. Sonuç olarak, İlk kez bu tez çalışması ile CITED2'nin CLOCK ile bağlanarak BMAL1/CLOCK transaktivasyonu üzerinde baskılayıcı etkiye sahip bir saat proteini olduğuna dair kanıt sunulmuştur.