Kriptokrom2 proteininin stabilite ve baskılama aktivitesini etkileyen tek nükleotit polimorfizmlerinin karakterizasyonu

Uyku düzeni, vücut sıcaklığı, metabolik aktiviteler gibi bir çok fizyolojik ve davranışsal olayın 24 saatlik periyotlar halinde düzenlenmesine sirkadyen ritim denir ve siyanobakteriden insanlara bir çok organizmada geçmişten günümüze korunmuştur. Bu ritim, dış faktörlere bağlı olmaksızın oluşmakta ve döngüsüne devam etmektedir, fakat dış etmenlerden gelen bilgiler içsel saatin dış ortam ile senkronize olmasını sağlar. Memelilerde dıştan alınan bilgilerle vücuttaki tüm dokuların hassas ayarını yapan ana saat süprakiazmatik çekirdekte (SCN) bulunur. Ana saat tüm dokuları, hormanlar ve sinir yolu iletimi ile senkronize etmektedir. Sirkadyen ritmin moleküler mekanizmasına bakıldığında karşımıza iç içe geçmiş transkripsiyonel-translasyonel geri bildirim döngüleri çıkmaktadır. Bu döngülerin pozitif kolunda CLOCK (Circadian locomotor output cycles kaput) ve BMAL1 (Brain and Muscle ARNT-Like-1) proteinleri kompleks oluşturup E-box (CACGTG) üstünden gerçekleşen gen ifadesini aktifleştirici rol oynarlar. Gen ifadesi aktifleştirilen genler arasında Per (Period) ve Cry (Cryptochrome) genleri de bulunur ve bu iki protein döngülerin negatif kolunu oluşturmaktadır. Sitoplazmada biriken PER ve CRY kompleks halinde hücre çekirdeğine giderek BMAL1/CLOCK ile etkileşime girer. Bu etkileşim zamana bağlı olarak gen ifadesi aktifleştirilmiş genlerin ifadelerinin baskılanmasına neden olur. Bu şekilde PER ve CRY kendi gen ifadelerini kendileri düzenlemiş olur, bu durum döngünün tekrar başlamasına olanak sağlamaktadır. Bu çalışmada 1000 Genom Projesi ve Ensembl Veri Bankasından seçilen nadir CRY2 varyantlarının sirkadiyen mekanizması üzerine olan etkilerinin çalışılması amaçlanmıştır. Bu amaç için öncelikle varyantların baskılayıcı aktiviteleri ölçülmüş, ardından, fare CRY2 proteinin 3 boyutlu yapısı kullanılarak varyantarın yerleri belirlenmiştir. Bu iki data seti verilerinin değerlendirilmesi sonunda CRY2'nin ikincil cep bölgesinin girişinde bulunan p.Pro123Leu CRY2, p.Ser210Ile CRY2 ve p.Asp406His CRY2 varyantları ile çalışılmaya karar verilmiştir. Doza bağlı baskılayıcı aktivite ölçümü deneyleri sonucunda PER2 proteinin bu üç CRY2 varyantının baskılayıcı görevlerini yerine getirmesi için elzem olduğu, hatta varlığında hala daha varyantların tam olarak yabanıl tipe kıyasla baskılayıcı etki sergileyemedikleri gösterilmiştir. Ardından yapılan kararlılık çalışmaları yabanıl tip CRY2 proteinin varyantlara göre çok daha kararlı olduğunu ve PER2 varlığında yabanıl tip ve varyantlar olmak üzere tüm CRY2 proteinlerinin yarılanma ömrünün yaklaşık iki katına çıktığı belirlenmiştir. Bunlara ek olarak, protein-protein etkileşim çalışmaları p.Pro123Leu CRY2, p.Asp406His CRY2 ve p.Ser410Ile varyantlarının yabanıl tipe göre CLOCK proteinine olan afinitelerinin azaltığı gözlemlenmiştir. Son olarak, bu çalışma p.Ser210Ile CRY2 ve p.Asp406His CRY2 varyantlarının Cry1-/-Cry2-/- fare embiriyonik fibroblast hücrelerinde ritimi geri getirebilecek kadar iyi bir baskılayıcı olmadığını göstermiştir. Bir bütün olarak bu çalışma ikincil cebin CRY2 proteinin kararlılık ve hücre seviyesinde düzgün çalışan sirkadiyen ritim için büyük rol oynadığını önermektedir.