Identification of novel transcription factors that modulate BMAL1: CLOCK transactivation

Sirkadiyen saatler kendi devamlılığını sağlayabilen ve yaklaşık olarak 24 saatlik periyotlarla günlük salınımı meydana getiren sitemlerdir. Sirkadiyen saatler insan fizyolojisini, endokronolojisini, karaciğer detoksifikasyonunu, hücre büyümesi ve davranışını etkiler. Memelilerde, sirkadiyen saat mekanizması pozitif ve negatif transkripsiyonel geri besleme döngülerine katılan birçok protein içermektedir. Pozitif geri besleme döngüsü BMAL1 ve CLOCK proteinlerini içerir. BMAL1 ve CLOCK proteinlerinin oluşturduğu heterodimer periyot (Per), kriptokrom (Cry) ve saat kontrolündeki diğer genlerin promotörlerinde E-box (CACGTG) bölgesine bağlanır. PER ve CRY proteinlerinin oluşturdukları heterodimer kazein kinaz I ε (CKIε) ile etkileşip çekirdeğe girer ve burada CRY, BMAL1:CLOCK 'a bağlı transkripsiyonun negatif düzenleyicisi olarak davranır. Fare üzerindeki genetik çalışmalar, ana saati moleküler seviyede düzenleyen daha birçok saat bileşeninin olduğunu gösterdi. BMAL1:CLOCK transaktivasyonu üzerinde etkili olan bileşenleri tanımlamak amacıyla yüksek kapasiteli (high troughput) lusiferaz tarama yöntemi kullanılarak 1400 adet memeli transkripsiyon faktörü taranmıştır. İlk tarama, WW bölgesi içeren transkripsiyon düzenleyici protein 1 (WWTR1)'in Per1 promotörü üzerindeki BMAL1:CLOCK transkripsiyon aktivitesini yüksek oranda baskılayan en iyi aday proteinlerden biri olduğunu gösterdi. Bu çalışmada, ko-immünopresipitasyon ve iki molekül floresan tamamlama analizini(BiFC) kullanarak WWTR1'in bu baskı faaliyetini Bmal1 ile fiziksel iletişime girerek gerçekleştirdiğini kanıtladım. WWTR1 proteininin sirkadiyen saatteki etkisini görmek için, NIH3T3 Per1: dluc ve U2-OS Bmal1: dluc hücre hatlarında Wwtr1 shRNA kullanılarak baskılandı. Her iki hücre hattında salınımın ritm genliğinde düşüş ve daha erken faz kaydedildi. Ek olarak, Wwtr1 ifadesinin düşüşü, çekirdek saat genlerinin transkripsiyonel düzenlenişini, özellikle Bmal1 ve Cry1 transkripsiyonunu etkiledi. Dahası, WWTR1; Cry1 ve Bmal1 promotörleri üzerinde yardımcı aktivatör gibi davranmaktadır. ChIP analizi ayrıca Cry1 promotörünün WWTR1 tarafından etkilendiğini gösterdi. Bütün bu sonuçlar, WWTR1'in BMAL1:CLOCK transaktivasyonunu baskılayarak ve Bmal1 ile Cry1 transkripsiyonel seviyesini düzenleyerek sirkadiyen ritmi düzenlediğini ve bu sebeple potansiyel yeni bir saat bileşeni olabileceğini önermektedir.