CRISPR-Cas9 based investigation of chromatin modifiers in human somatic cell reprogramming

Somatik hücrelerin Oct4, Sox2, Klf4 ve c-Myc transkripsiyon faktörleri ile pluripotensiye yeniden programlanması, epigenomun kromatin modifiye edenler aracılığıyla yeniden biçimlenmesiyle gerçekleşir. Bu bağlamda çalışılan genlerin bazıları yeniden programlamanın bariyer ve gerekli genleri olarak adlandırılmıştır. Bununla birlikte gelişen protokollerle yapılan geniş kapsamlı çalışmaları, yeniden programlanmanın beraberinde gelen shRNA verktörlerinin susturulmaya duyarlılığı ve bu genlerin knockout olduğu insan hücre hatlarının bulunmaması sınırlandırıyor. Böylece, yeniden programlanmanın farklı evrelerinde bu genlerin kalıcı modifikasyonuyla CRISPR-Cas9 knockout kütüphanesi kullanarak kromatin modifiye edenlerin sistematik incelenmesi hipotezini belirledik. Bu amaçla, 247 histon ve DNA modifiye eden kromatin yeniden düzenleyiciler, yazıcılar, okuyucular ve siliciler içeren kromatin modifiye edenlerin CRISPR-Cas9 kütüphanesi oluşturuldu. Ardından bu kütüphane, heterojen hücre popülasyonu oluşturulması ve sonrasında OSKM ile yeniden programlanmaya tabi tutulmasında kullanıldı.Bunun için, FACS aracılığıyla ayrıştırılmış Tra-1-60 pozitif ve retroviral yolla eksojen olarak üretilen yeşil floresan proteinleri (EGFP) susturulmuş hücrelerden elde edilen uPKH'lerden farklı zaman aralıklarında toplanılanlar kullanıldı. İzole edilen hücrelerde CRISPR rehber RNA'ların miktarı ileri nesil sekanslama yöntemi ile belirlendi. Spesifik rehber RNA'ların çokluğunun analizi, önceden çalışılmış ve ispatlanan somatik hücrelerin yeniden programlanmasının düzenleyicilerini doğruladı ve farklı dönemlere özgü yeni bariyer ve gerekli düzenleyiciler saptandı. Bunlardan PAXIP1, BRD2 ve USP22 bariyer ve CHAF1A, KDM8 ve PRMT5 gerekli düzenleyiciler olarak belirlendi. Üstelik gen kümelerinin işleve dayalı analizi, MLL komplekslerinin yeniden programlanmanın muhtemel bariyeri, BAF, SWI/SNF ve MOZ/MORF komplekslerinin de önemli düzenleyiciler olarak görev aldıklarını açıkladı. Tarama sonuçlarına dayanarak, farklı dönemlere özgü inhibitörlerin kombinasyonlarının kullanılmasının, yeniden programlanmayı hızlı ve daha verimli hale getirdiği görüldü. Bu çalışma yeniden programlamanın kromatin bazlı engellerinin açıklanmasına ve daha verimli yeniden programlama yolları için rehber olacaktır.