CRISPR/CAS9 kullanılarak sığır preimplantasyon embriyolarının trofektoderm farklılaşmasında CDX2 rolünün araştırılması

Model memeli hayvan olarak farelerde zigottan blastosiste dönüşüm sürecinde hücre soyu farklılaşması hakkında detaylı çalışmalar yürütülmüş olmasına rağmen sığırlarda bu süreç belirsizliğini korumaktadır. Bununla beraber, yardımcı üreme teknikleri kullanılarak üretilen sığır embriyolarında sıklıkla yaşanan erken gebelik kayıpları çözülmesi gereken bir sorun olarak güncelliğini korumaktadır. Preimplantasyon gelişim sırasında meydana gelen trofektoderm (TE) ve iç hücre kitlesi (ICM) farklılaşmasında etkili olan faktörlerin doğru bir şekilde anlaşılmasıyla erken gebelik kayıpların önlenebileceği öngörülmektedir. Bu kapsamda, sığırların preimplantasyon gelişim sürecinde yer aldığı ve fare embriyolarında TE/ICM soylarının farklılaşması için gerekli olduğu bilinen kaudal tip homeobox transkripsiyon faktörü-2 (CDX2) geninin sığırlardaki rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, CRISPR/Cas9 teknolojisi ile CDX2 geni susturulmuş (Knock-out) olan embriyolar in vitro üretilerek, CDX2 geninin susturulmasının sığır preimplantasyon gelişimine etkisi takip edilmiştir. Çalışma materyalini mezbahalardan alınan ovaryumlardan elde edilen oositler oluşturmuştur. Sığır oositlerine sadece Cas9'u kodlayan mRNA enjekte edilerek kontrol grubu ve CDX2 hedefli sgRNA+Cas9 mRNA enjekte edilerek deney grubu oluşturulmuştur. Preimplantasyon gelişiminin 8. günündeki sığır blastosistleri fikse edilerek TE/ICM hücrelerinin belirlenmesi için sırasıyla CDX2, GATA3 ve SOX2 immünositokimyasal boyama ile görüntü analizi yapılarak embriyo morfolojisi incelenmiştir. Hangi embriyoların CDX2 geni bakımından başarıyla susturulduğunu belirlemek için DNA izolasyonu yapılmış ve miSeq teknolojisi ile genotiplenmiştir. Tüm analizler sonucunda, CDX2 geni bakımından kontrol ve deney gruplarında embriyo gelişimi bakımından istatistiksel bir fark olmadığı tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında ulaşılan bilgiler fare embriyoları ile kıyaslandığında sığır embriyolarının trofektoderm farklılaşmasında blastosist oluşumunda CDX2'nin hayati bir rol oynamadığını göstermiştir. Ayrıca memeli türleri arasında embriyo gelişimi sırasında ilk hücre soyu farklılaşmasının aynı olmadığı belirlenmiştir. Bu sonuçlara dayanarak, yardımcı üreme teknikleri kullanılarak üretilen sığır embriyolarında meydana gelen kayıpların sebeplerinin belirlenmesi için sürece dahil olduğu öngörülen bütün genlerin araştırılması gerektiği söylenebilir.