CRISPR-based synthetic translational regulation using non-conventional yeast

Verimli ve programlanabilir gen ekspresyon sistemleri, Pichia pastoris gibi model olmayan maya konakçılarında rekombinant protein üretiminin iyileştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu tez kapsamında, P. pastoris'te rasyonel olarak tasarlanmış GAP promotorları ile CRISPR/dCas9 tabanlı transkripsiyonel aktivasyon modüllerinin entegrasyonu yoluyla sentetik bir gen düzenleme platformu kurulmuştur. Bu çalışmanın temel amacı, doğal olarak konstitutif ifade gösteren GAP promotorunu, gRNA aracılığıyla efektör bölgelerin yönlendirilmesiyle hem aktivasyon hem de represyon yapılabilecek şekilde ayarlanabilir bir yapıya dönüştürmektir. Böylece, ortogonal ve bağlama-özgü kontrol sağlanması hedeflenmiştir. Bu amaçla, GAP promotorunun çekirdek işlevini bozmadan yeni gRNA bağlanma bölgeleri oluşturmak üzere iki farklı sentetik versiyon (versiyon 1 ve versiyon 2) rasyonel mutasyonlarla tasarlanmıştır. Bu promotorlar, eGFP raporlayıcı geninin önüne klonlanarak P. pastoris genomuna entegre edilmiştir. Glukoz, gliserol, etanol ve metanol gibi çeşitli karbon kaynakları altında yapılan koloni taraması sonucunda, çoğu mutant promotorun doğal tip PGAP promotoru ile karşılaştırılabilir düzeyde ekspresyon sağladığı gözlenmiştir. Bazı kolonilerde ise yüksek eGFP üretimi gözlenmiş ve bu durum, qPCR analizi ile doğrulanan çoklu gen kopya sayısına bağlanmıştır. Bu nedenle, deneylerin sağlıklı yorumlanabilmesi için tek kopya taşıyan koloniler seçilerek sonraki aşamalarda kullanılmıştır. Ardından, dCas9, MS2-bağlayıcı scaffold RNA'ları ve VP64 aktivasyon domenini içeren CRISPRa sistemi, seçilmiş tek kopya taşıyan kolonilere aktarılmıştır. Her promotor versiyonuna yönelik beşer adet olmak üzere toplam on özel tasarlanmış gRNA, dört farklı karbon kaynağı altında test edilmiştir. Özellikle versiyon 1, belirli gRNA'larla, en dikkat çekici olarak da v1-g2-c1 ile, tüm koşullarda anlamlı düzeyde eGFP aktivasyonu sağlamıştır. Buna karşın, versiyon 2 ile anlamlı bir aktivasyon elde edilememiş; bu durum, muhtemelen bağlanma bölgesinin konumu ya da promotor dizisindeki inhibe edici mutasyonlara bağlanmıştır. Bu çalışma, P. pastoris'te sentetik promotorlar üzerinde CRISPRa bileşenleri kullanılarak dinamik kontrol sağlayan modüler ve ortogonal bir transkripsiyonel düzenleme sistemini tanıtmaktadır. Sunulan yaklaşım, geleneksel indüklenebilir promotorlara alternatif olarak, gelecekteki metabolik mühendislik stratejileri ve endüstriyel rekombinant protein üretim uygulamaları için özelleştirilebilir ve kontrol edilebilir gen ekspresyon sistemlerinin geliştirilmesine zemin hazırlamaktadır.