The development of genetically encoded imaging methods to study redox state and maturation of cytochrome C protein

Biyolojik imleşim ve ileri mikroskobik görüntüleme teknikleri için kullanılan genetik olarak şifrelenen floresan habercileri, oksidatif stres altında hücrede gerçekleşen değişim mekanizmalarını açıklamada önemli bir rol oynarlar. Bu sebeple imleşimin görüntülenmesi ve dışarıdan gelen uyarıcıya verilen tepkinin yüksek uzamsal zaman çözünürlüğünde ölçülmesi için sayısal metotlar sağlar. Düşük toksiklik, yüksek imleşim-parazit oranı farklı hücre tiplerinden imleşim alabilme ve kompleks biyolojik yollarda hassasiyet gibi özelliklerinden ötürü bu metodlar çokça tercih edilmektedir. Canlı organizmaların dengeleşimlerini sağlaması ve koruması için redoks mekanizması önemli bir metobolik yoldur. Görevleri arasında enerji üretimi solunum çemberini tamamlamak hücresel redüksiyon özgür radikallerin düzenlenmesi ve apaptoziz başlatılması yer alır. Oksidatif hasar ve dengesiz redoks yayılımı yaşlanma, nörodejaneratif hastalıklar ve hipoksi gibi istenmeyen sonuçlara sebebiyet verebilir. Bu yüzden redoks mekanizmasına dahil ögelerin daha iyi anlaşılması hücre içi imleşim görevi hakkında faydalı bilgileri ortaya çıkarabilir. Redoks aktif demir proteinleri ailesinin bir üyesi olan Cytochrome c (Cyt c), pek çok hücre içi redoks reaksiyonunun gerçekleştiği mitokondrinin iç membranında bulunmaktadır. Asıl görevi, mitokondrinin membranı üzerinden ATP üretiminde yer alan elektron taşıma çemberine elektron transfer etmektir. Bu yüzden Cyt c'nin mitokondrinin redoks mekanizmasındaki kilit rolü, redoks biyogenezini anlamamız için kendisini iyi bir aday olarak öne çıkarmakta ve redoks mekanizması kaynaklı hastalıkların tanısı ve tedavisine ışık tutmaktadır. Bu çalışmada mikrobik proteinlerden arındırılmış Cyt c'nin redoks durumunun görüntülenmesi ve saptanması gösterilmiş, canlı hücrelerde floresan rezonans enerji transferi (FRET) sayesinde Cyt c'nin olgunlaşması ve Cyt c Heme Lyase proteiniyle olan etkileşimi çalışılmıştır. Cyt c'nin oksidasyon durumu fotokromik FRET (pcFRET) metoduyla tespit edilmiştir ki, bu metotta redoks durumuna bağlı olarak değişiklik gösteren Cyt c absorpsiyonu, Cyt c'ye bağlı olan floresan habercisinin emisyonunu modüle etmektedir. Cyt c'nin farklı redoks bileşenleri ile uyarılan sürekli oksidasyon durumu değişimi açıkça gösterilmiştir. Son olarak canlı hücrelerde Cyt c'e heme lyase proteini yardımıyla hemin kofaktörünün yerleştirilmesi, Cyt c'nin katlanması ve redoks proteinleri etkileşimleri tek hücre floresan sinyali izleme metoduyla çalışılmıştır. Aynı zamanda canlı hücrelerden direkt olarak alınan sinyalin karakterizasyonu için her resimde düzeltilmiş florofor katsayısı kullanan orijinal bir FRET izleme metodu raporlanmıştır.