Development of novel superparamagnetic iron oxide based theranostic nanoparticles

Süperparamanyetik demir oksit nanoparçacıklar (SPIONs) ilaç taşınımı, manyetik rezonans görüntüleme (MRI), hipertermi ve doku mühendisliği gibi sürekli gelişen nano tıp alanlarında çok fazla kullanılan nano platformlardır. SPION ların bu kadar fazla ilgi görmesi yüksek biyo uyumlulukları ile ilişkilidir, öyle ki klinik onaylı tek metal oksit nano parçacık türüdür. Kolay sentezlenebilmeleri, yüksek ve noninvaziv görüntüleme imkanı vermeleri ve farklı yüzey kimyalarına açık olmaları da diğer avantajlarından bazılarıdır. Nano-teranostik alanına hatırı sayılır katkılarına karşın, SPION' ların potansiyeli, yeterince özgün kombinasyonlar kullanılarak değerlendirilmemektedir. SPION ların görüntülenme kapasiteleri MRI ile kısıtlıdır. Fakat sonradan eklenilen ve demir oksit çekirdeğinden ötürü zaman içinde ışıması kaybolan floroforlar ile çoklu görüntülenme imkanları yaratılabilmektedir. Buna karşın, luminesan bileşikler ile demir oksit çekirdeğinin etkileşimi, organik floroforun demir oksit üzerinde ışıma kaybına uğradığını gösteren birkaç çalışma dışında yeterince açığa çıkarılmamıştır. Özellikle, demir oksit- poliamin kombinasyonları literatürde gen aktarımında sıkça kullanılmasına karşın, demir oksit çekirdeğinin poliaminlerin zayıf ışımasına nasıl etki ettiği çalışılmamıştır. Bu noktada, dallı polyetilenimin (bPEI) kaplı demir oksit nano parçacıklar üzerine olan çalışmamız bPEI'e ait zayıf, mavi ışımanın demir oksit çekirdeği üzerine kaplandığında çok yüksek ölçekte ve metoda bağlı olarak arttığını ve uyarılma dalga boyuna bağlı ışıma gösterdiğini ortaya çıkarmıştır. Bu özgün bulgu, özellikle demir oksit çekirdeğinin elektromanyetik tayftaki görünür dalga boyunu soğurduğu bilgisi dikkate alındığında ilginçtir. Titizlikle sürdürülmüş spektroskopik ve teorik çalışmalar, bPEI'e ait zayıf ışımanın bu denli artmasının nedenlerini ortaya çıkararak poliamin literatürüne önemli katkıda bulunmuştur. Sonuç olarak, PEI'e ait amin gruplarının yükseltgenmesi, nano parçacık yüzeyine tutunan bPEI' nin moleküler hareketliliğinin kısıtlanması asidifikasyon etkisi ile birleşerek bPEI/SPION a ait bu güçlü ışımanın arkadaşındaki temel etkeni oluşmuştur. Ayrıca, bu kendinden mavi ışıma özelliğine sahip SPION'ların teranostik potansiyeli de, PEI üzerindeki amin gruplarının yükseltgenmesinin bPEI/SPION un gen taşıma ve MRI sinyali üretme özelliklerini kayba uğramadığını temin etmek amacıyla test edilmiştir. Beklenildiği üzere, bahsedilen bPEI/SPION ların hücre içinde güçlü mavi ışıma verdikleri konsantrasyonda, kayda değer T2 MR sinyali de ürettikleri kaydedilmiştir. Buna ek olarak, söz konusu amin gruplarındaki kimyasal yükseltgenmenin PEI'nin gen taşıma işlevinin önünde engel teşkil etmediği, model oligonüklotit poly I:C nin servikal kanser hücre hattı HeLa ya başarılı bir şekilde aktarılmasıyla gösterilmiştir. Kısaca, nano tıpta yaygın olarak kullanılan bPEI kaplı SPION lar hakkındaki bu önemli bulgu, hem luminesan poliaminlere ait literatüre konseptsel gelişme sunmuş, hem de bPEI kaplı demir oksitlerin nanoparçacıkların yeni görüntüleme yeteneğini açığa çıkararak kapsamını genişletmiştir. Nano tıpta karşılaşılan en önemli problemlerden birisi, gen taşıyıcı nano parçacıkların gen taşıma verimlerinin yüksek tutulması amacıyla, toksik poli katyonik bileşenler ile sınırlandırılmasıdır. Bu durum, SPION ların yüksek biyo-uyumluluk potansiyeline özellikle engel teşkil etmektedir. Bu nedenle, demir oksit çekirdeğinin gösterdiği biyo-uyumluluk özelliğinden bütünüyle yararlanmak için, polikatyonik yapıların bertaraf edilmesiyle daha güvenli ve yüksek fonksiyonellikle SPION bazlı gen taşıyıcı tasarımların geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Gen aktarım çalışmalarında yer alan bu güncel problem ile ilgili olarak, özgün, çok fonksiyonlu, SPION bazlı mikro RNA (miRNA) ilaç taşıyıcı ajanlar daha güvenli gen aktarımı gerçekleştirmek amacıyla tarafımızdan ileri sürülmüştür. Bu motivasyonla, hücre dışı ortamda miRNA taşıdığı bulgusundan hareket ederek, doğal miRNA taşıyıcı protein Argonaute 2 (AGO2) nun SPION yapılarıyla birleştirilmesi amaçlanmıştır. Bu özgün tasarımların miRNA aktarma potansiyelleri, hedeflenebilir ve görüntülenebilir olması yaklaşımıyla meme kanserine karşı test edilmiştir. Bu amaçla, hedefleme etiketi (antiHer2 proteini) ve uzak kırmızı bölgede ışıma gösteren floresan etiket (Cy5), AGO2 bağlanmış SPION lara eklenmiştir. Nihahi ürün, otofaji ile ilintili miR376b terapatiklerinin Her2 büyüme reseptörünü yoğun salgılayan meme kanseri hücrelerine seçici ve görüntüleme eşliğinde aktarılmasını sağlamak üzere tasarlanmıştır. SPION- protein kompleksi, içeriğindeki her bir yapı taşının işlevselliğini korumak üzere en etkin biyo-konjügasyon teknikleri kullanılarak elde edilmiştir. Geliştirilen SPION-protein birleşenleri Her2 reseptorünü yoğun olarak salgılayan MDA-MB-453 ve SKBR3 meme kanseri hücrelerinde mükemmel in vitro ve in vivo biyo-uyumluluk ve hedefleme özellikleri göstermiştir. Ayrıca, SPION-protein konjugatlarının miR376b mimiklerini aktarabilme özellikleri, MDA-MB-453 ve SKBR3 hücreleri ile yapılan ve yerel miR376b lerin seviyesindeki artış şeklinde tayin edilen in vitro testler ile doğrulanmıştır. Söz konusu SPION ların in vivo miRNA aktarma verimleri ise halen yürütülen meme kanseri tümör küçültme çalışmalarıyla ile değerlendirilmektedir. Bütün olarak ifade edildiğinde, geliştirilen anyonik, ultra küçük, koloidal olarak kararlı ve çok fonksiyonlu SPION-protein birleşenleri, AGO2-miRNA kompleksleşmesini ilk kez canlı dışı ortamda gerçekleştiren literatürde öncül formulasyonlardır. Bununla birlikte, söz konusu SPION-protein birleşenleri güvenli ve başarılı miRNA aktarım çalışmaları için güçlü adaylarladır. Moleküler hedefleme, yeni jenerasyon teröpatikler tarafından sunulan ve daha az doz ile daha yüksek teröpatik etki görülmesini sağlayan gelişmiş bir stratejidir. Ancak sözü edilen yetkinliğine rağmen, hedefleme yaklaşımı kanser hücrelerindeki her bir afinite birleşeni göz önüne alınarak geliştirilmelidir. Bu gelişmiş hedefleme uygulaması, özellikle meme kanseri gibi birden çok moleküler belirtisi olan hastalıklar için değerlidir. Meme kanseri, hücre yüzeyinde yoğun salgılanan birden çok tipte reseptörün varlığı sebebiyle önemli derecede heterojen bir hastalıktır. Bu nedenle, tek tip hücre yüzeyi reseptörünü hedeflemek bazen tek bir tümörde dahi birden fazla hücre tipi bulunduran meme kanseri için çalışan bir yöntem değildir. Bu amaçla, meme kanseri hücreleri yüzeyinde yoğun salgılanan Her2 ve EGFR sinyal verici reseptörleri aynı anda tanıyan SPION-antikor birleşenleri tarafımızdan geliştirilmiştir. Çift dalga boyunda ışıma gösteren (yeşil ve uzak kırmızı) ve çift hedefli bu SPION- antikor birleşenleri, yine bio-konjügasyon teknikleri esas alınarak tasarlanmıştır. Moleküler hedefleme yeteneklerinin ötesinde, SPION-antikor birleşenleri süperparamanyetik demir oksit çekirdeğinin varlığının avantajı ile manyetik olarak da hedeflenebilmektedir. Çift hedefli SPION-antikor birleşenleri anyonik, koloidal olarak kararlı ve vücut içerisinde dolaşabilecek kadar küçük olarak elde edilmişlerdir. Söz konusu SPION-antikor birleşenlerinin hedefleme verimini göstermek için, halen sürdürülmekte olan ve farklı düzeyde Her2 ve EGFR salgılayan meme kanseri hücreleri üzerinde yapılan görüntüleme bazlı (FACS) hücre içi alınım testleri tasarlanmıştır. in vitro testlerin tamamlaması ile, çiftli hedeflenebilen SPION ların moleküler hedefleme yaklaşımını daha spesifik ve daha akıllı hale getireceği öngörülmektedir. Özetle, bu tez, eski SPION kompozisyonlarına yeni görüntüleme seçenekleri sunarak, miRNA taşıyıcı SPION ların biyo-uyumluluğunu önemli ölçüde yükselterek ve moleküler hedefleme stratejilerini güçlendirerek literatürde yer alan SPION bazlı teranostik çalışmalara katkı sağlamayı amaçlamaktadır.