Deneysel testis torsiyonu modelinde hidrojen sülfürün etkinliğinin araştırılması

Amaç: Testis torsiyonu spermatik kordun vertikal eksende dönmesi ile testis ve yapılarının kanlanmasının bozulmasına bağlı olarak testiste kalıcı iskemik hasara sebep olabilen akut seyirli, her yaşta görülebilen ve hızlı tanı ve tedavi gerektiren ürolojik acil bir durumdur. Doğru teşhis konulamaz, uygun ve erken tedavi yapılmazsa geri dönüşümsüz testis kaybı ile sonuçlanabilmektedir. Testis hasarının oluşmasında iskeminin etkisi ile birlikte testisin detorsiyonu sonrasıda gelişen reperfüzyonun da etkisi vardır. Testis torsiyonunda bu iskemi/reperfüzyon hasarını azaltmak için birçok tedavi yöntemi denenmekte ve araştırılmaktadır Hidrojen sülfür (H₂S) renksiz, yanıcı, uçucu ve karakteristik çürümüş yumurta kokusuna sahip suda çözünebilen bir gazdır. Uzun yıllar toksik bir gaz olduğu bilinen H₂S' in daha sonra Kımura ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda organizmada endojen olarak sentezlendiği ve birçok fizyolojik ve patolojik süreci etkilediği saptanmıştır. Wang ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalar sonrası karbon monoksit (CO) ve nitrik oksit (NO)'ten sonra üçüncü gazotransmitter olarak kabul edilmiştir. H₂S' in kardiyovasküler sistemin düzenlenmesinde, hücre proliferasyonu ve apoptozunda, glukoz metabolizmasında, nörotransmisyonda, inflamasyonda ve damar yataklarında gevşetici etki gösterdiği çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda H₂S tedavisinin oksidatif stresin neden olduğu doku hasarını iyileştirdiği ve iskemi /reperfüzyon hasarınının önlenmesinde rolü olduğu gösterilmiştir. Özellikle enflamasyonun düzenlenmesi konusunda önemli bir rol oynadığı ve doğru oranda kullanılan hidrojen sülfidin iskemi / reperfüzyon hasarına karşı inhibitör-enflamatuvar sitokinlerin salınmasını sağlayarak antiinflamatuar, antioksidan ve ayrıca antifibrotik aktiviteye katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu özelliği ile hidrojen sülfür iskemi /reperfüzyon , şok, sepsis tedavisinde de kullanılabilir. Testis torsiyonuna bağlı iskemi / reperfüzyon hasarı sonrası testislerde meydana gelen histolojik ve fonksiyonel değişiklikleri ve farklı tedavi metodlarını inceleyen çok sayıda yayın bulunmaktadır. İskemi/reperfüzyon hasarını azaltmak için, serbest radikal kurtarıcıları da içeren birçok farmakolojik ajan kullanılmıştır. H₂S tedavisi de testisteki iskemi/reperfüzyon hasarında, hasarı sınırlamak ve geri çevirmekte kullanilabilecek bir serbest radikal kurtarıcısıdır. Hidrojen sülfür tedavisiyle ilgili birçok yeni çalışma olmasına karşın literatür verileri incelendiğinde testis torsiyonu ile ilgili bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu tez çalışmasında amacımız testis torsiyon-detorsiyonu modeli oluşturduğumuz sıçanlarda testistin iskemi ve reperfüzyonuna bağlı oluşan hasarın önlenmesinde hidrojen sülfür (H₂S) tedavisinin iskemi/reperfüzyon hasarına etkisini biyokimyasal ve histopatolojik parametreler kullanarak araştırılmasıdır. Materyal ve Metod: Deneysel çalışmada 18 adet erkek, erişkin, ortalama ağırlığı 300- 400 gr olan Wistar albino cinsi sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar sıcaklığı 21+/- 2 °C, %40-60 bağıl nem altında ve ışık 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde bir odadaki ayrı kafeslere yerleştirildi. Tüm sıçan deneylerinde, İstanbul Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanan protokole uygun hareket edildi. Sıçanlar her grupta 6 adet olacak şekilde rastgele seçilerek 3 gruba ayrıldı. 1. Grup cerrahi stres uygulanan sham grubuydu. 2. Grup testis torsiyonu yapılıp 1 saat sonrasında detorsiyon yapılan iskemi reperfüzyon grubuydu. 3. Grup ise testis torsiyonu yapılması sonrasında detorsiyondan 30 dk önce iskemi evresinde Hidrojen sülfür kaynağı olarak NaHS (Sodium hydrosulfide monohydrate , Sigma-Aldrich) kullanılarak normal salinle çözündürülmesi sonrası oluşan çözeltinin (1ml salin de 10 mg/kg/gün doz NaHS) intraperitoneal olarak uygulandığı I/R+NaHS tedavi grubuydu. Tüm cerrahi işlemler intraperitoneal ketamin ( 50 mg/ kg) ve ksilazin (10 mg/ kg) anestezisi altında yapıldı. Operasyonlarda midskrotal vertikal insizyon sonrası bilateral testisler serbestlendi ve insizyon dışına alındı. Sham grubuna torsiyon uygulanmadan tekrar scrotuma yerleştirildi. Diğer tüm gruplarda bilateral testislerin serbestlenmesinin ardından 720º torsiyone edilerek nontravmatik sütürler ile tespit edildi.1 saat sonrasında detorsiyon yapıldı. Yalnızca tedavi grubu olan I/R+ NaHS grubuna torsiyon süresinin 30dk sında intraperitoneal olarak NaHS çözeltisi enjeksiyonu uygulandı. Testis torsiyonu toplam süresi bir saat olunca testisin dartosa sabitleme sütürü kesilerek testisler manuel olarak saat yönünün tersi yönünde detorsiyone edilerek reperfüzyon sağlandı. Ardından testisler skrotuma yerleştirilerek anatomik katlar nontravmatik sütür ile kapatıldı. Postoperatif ilk günden itibaren 1 hafta boyunca I/R +NaHS grubuna intraperitoneal olarak günde 1 kez olmak üzere NaHS çözeltisi enjeksiyonu uygulandı. Tüm grupların detorsiyonun 7. gününde skrotum eski insizyon yerinden açılarak bilateral orşiektomi yapılarak doku ve aynı zamanda kan örnekleri alındı. Deney bitiminde bilateral orşiektomi sonrası alınan testis dokuları sol testis ve sağ testis olmak üzere ayrıldı. Sol testislerin tümü histopatolojik inceleme için Bouin solüsyonunda fikse edilerek Patoloji Anabilim Dalına gönderildi. Sağ testislerinde tümü serum fizyolojik ile yıkandıktan ve steril şekilde kurulandıktan biyokimyasal işlemler için ölçüm yapılacağı güne kadar – 80°C'de derin dondurucuya kaldırıldı. Sıçanlardan biyokimyasal işlemler için intrakardiyak kan alındıktan sonra yüksek doz anestezi altında sakrifiye edilerek deneyin cerrahi kısmı sonlandırıldı. Bulgular: Grupların intraoperatif ve postoperatif cerrahi değerlendirmesinde 1. grup olan sham grubuna göre makroskopik görünümü baz alındığında, 2. Grup olan ve torsiyon uygulanan I/R grubunda doku canlılığının kötüleştiği, hidrojen sülfür uygulanan 3. Grup olan I/R+NaHS grubunda ise I/R grubuna göre daha iyi doku canlılığının olduğu saptandı. Bir saatlik torsiyon süresinin sonunda testiste mor renk değişikliği ve ödem artışının olduğu görüldü. Testislerin detorsiyone edilmesi sonrasında testislerin renginde kısmi düzelme olmasına rağmen minimal ödemin devam ettiği gözlendi.1 hafta sonra yapılan orşiektomi sonrasında özellikle I/R grubunda testislerdeki mor rengin minimal olduğu ve 1 tanesinde atrofi geliştiği, sham grubuyla I /R +NaHS grubu testisleri arasında morfolojik olarak belirgin fark saptanmadı. Yapılan mikroskobik incelemede sham grubunda normal spermatogenez gösteren seminifer tubulusların olduğu I/R grubunda seminifer tübül yapılarının ve spermatogenik hücrelerin düzeninin bozulduğu, tübül içerisinde çok çekirdekli granülasyon hücrelerinin gözlendiği, bazı seminifer tübülüslarda spermatogenik hücrelerin bulunmadığı, I/R +NaHS grubunda ise seminifer tubuluslarda spermatosit ve spermatozoa düzeyine ulaşan maturasyon gösteren germ hücreleri saptandı. Histopatolojik incelemede modifiye Johnsen skorlaması kullanılarak bu skora göre gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulundu ( p<0.05). Farklılığın tespiti için yapılan ikili karşılaştırmalar sonucunda; sham grubunun değerleri ile I/R grubu arasında yapılan değerlendirme sonrasında sham grubunun değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde yüksek olduğu saptandı. (p<0.05).I/R grubunun değerleri ile I/R+NaHS grubunu değerlerinin karşılaştırılması sonrasında I/R grubu değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde düşük olduğu saptandı (p<0.05). Sham grubu ve I/R+NaHS grubu arasında ise Johnsen skoru değerleri açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamadı. (p>0.05) Serum ve testis dokusu TNF-α düzeylerine bakıldığında gruplar arasında anlamı bir değişiklik göstermediği saptandı. (p>0,05). Miyelperoksidaz (MPO) aktivitesinin I / R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı artışlar gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda H₂S uygulaması ile artmış olan MPO aktivitesi düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu saptandı. (p<0,05).Yine aynı şekilde ileri oksidasyon protein ürünü (AOPP) aktivitesinin I / R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı artışlar gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda H₂S uygulaması ile artmış olan AOPP aktivitesi düzeylerinde anlamlı bir azalma olduğu saptandı. (p<0,05) Malondialdehit(MDA) düzeylerine bakıldığında gruplar arasında anlamı bir değişiklik göstermediği saptandı. (p>0,05) . Glutatyon (GSH) düzeylerinin I/ R grubundaki sıçanların testis dokusunda sham grubuna göre anlamlı bir azalma gösterdiği ve I/R+NaHS grubunda ise H₂S uygulaması ile GSH düzeylerinde anlamlı bir artış gösterdiği saptandı. (p<0,05) Buna karşılık Süperoksit dismutaz (SOD) , Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ve Demir azaltıcı antioksidan güç (FRAP) aktivitelerinde herhangibir değişiklik görülmedi. Sonuç: Testis torsiyonunda hidrojen sülfürün detorsiyon sonucu oluşan iskemi/reperfüzyon hasarını önlemede etkili olduğunu saptadık. Fakat literatürde bu konuyla ilgili ilk çalışma olduğundan saptadığımız bulguların daha geniş kapsamlı deneysel çalışmalarla desteklenmesi gerekmektedir. Anahtar Kelimeler: Testis torsiyonu, Hidrojen sülfür, İskemi, Reperfüzyon hasarı, Oksidatif stres