Diabetes insipidus'lu hastaların AQP2 geninde tanımlanan mutasyonların fonksiyonel analizleri

Vücutta su homeostazı, su alımı ve kaybının dengede olması ile sağlanır. Diabetes insipidus (DI) hastalarında yapımı ve etkisi azalmış olan arjinin vazopressin, (AVP, ADH, antidiüretik hormon) beynin hipotalamus bölgesinde sentezlenen ve hipofiz bezinin arka bölümünde depolanarak uyarılma durumunda salgılanan bir hormondur. Bu hormon, böbrek toplama kanalındaki suyun geri emilimini artırarak, hayati fonksiyona sahip olan bir düzenleme gerçekleştirmektedir. AVP hormonu salgılandıktan sonra, böbrek nefronlarının polarize epitel hücrelerinin bazolateral membranında lokalize bir transmembran protein olan arjinin vazopressin reseptör 2'ye (AVPR2) bağlanır. AVPR2, bir G protein bağlı reseptördür (GPCR). Bu şekilde G proteini aktive olur ve adenilat siklazı aktive eder. Sonuçta, oluşan cAMP, protein kinaz A'yı stimüle eder. Protein kinaz A, hücre içerisinde bulunan aquaporin su kanalı (AQP2) proteinlerini fosforilleyerek onların tetramerler halinde apikal membrana yerleşimlerini sağlar. Bu kanallar vasıtasıyla suyun idrardan böbrek hücrelerine geçişi sağlanır. Su geri emilimi uyarısı sona erdiğinde, AQP2 endositoz ile membrandan uzaklaştırılır. Bu kontrol sistemi içerisinde oluşabilecek herhangi bir patoloji vücudun su homeostazının bozulmasına ve DI gelişimine neden olur. AQP2, böbrek ana toplayıcı kanal hücrelerinde, suyun geri emiliminden sorumlu olan homotetramerik bir su kanalıdır. AQP2 genindeki mutasyonlar, fazla hacimde idrar üretilmesine neden olarak, vücut su homeostazının sağlanma sürecinde patojenik bir durum olan nefrojenik DI'yi (NDI) indüklemektedir. Bu mutasyonların NDI patogenezindeki rolü için literatürde yer alan klinik ve deneysel gözlemlerle kanıtlanmış çeşitli hipotezler vardır. AQP2 gen mutasyonlarının genelde mutant proteinin yanlış katlanmasına ya da bu proteinin yanlış hedeflenmesine yol açtığı tespit edilmiş olmakla birlikte; işlevsel olmayan su kanallarının, doğru membran hedeflemesi gösterdiği de bildirilmiştir. Bu çalışmanın amacı, NDI tanısı konmuş hastaların AQP2 geninde grubumuz tarafından tanımlanmış olan A45T, R85X ve A147T mutasyonlarının fonksiyon analizlerini gerçekleştirmektir. Bu amaç kapsamında yapılan deneysel çalışmalarda; yabanıl tip kodlayıcı AQP2 dizisi taşıyan ifade vektörü temin edilmiş, site-directed mutagenez yöntemi kullanılarak mutant AQP2 gen dizilerini içeren uygun ifade vektörleri hazırlanmıştır. Bu süreci takiben, yabanıl tip ve mutant vektörlerin MDCK hücrelerine stabil transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Vektörlerin MDCK hücrelerinde ifadesi sağlanarak, mutant proteinlerin hücre içi olgunlaşma sürecinin karakterizasyonun araştırılması için deglikozilasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca proteinlerin yarı-ömürlerinin belirlenmesi amacıyla, siklohekzimid analizi yapılmış ve hem deglikozilasyon deneyleri hem de siklohekzimid deneylerine ait sonuçlar immünblot analizi ile değerlendirilmiştir. Mutant AQP2 proteinlerinin hücre içi trafiğinin belirlenmesi için immünsitokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir. AQP2 gen mutasyonlarının Xenopus laevis oosit ifade sisteminde gerçekleştirilecek fonksiyon analiz çalışmaları kapsamında ise, yabanıl tip ve mutasyonu bulunduran oosit ifade vektörlerinden elde edilen cRNA'ların oosit hücrelerine injeksiyonu gerçekleştirilerek, AQP2 proteininin oositlerde ifade düzeylerini tespit edebilmek için total membran ve plazma membranları izole edilmiş, yabanıl tip protein ile mutant proteinlerin membranlardaki oranları immünblot analizi ile karşılaştırılmıştır. Mutant AQP2 proteinlerinin su alım mekanizması üzerine etkilerinin belirlenmesi için oosit hücrelerine su geçirgenliği testi uygulanmıştır. Sonuç olarak tez kapsamında, çalışılan tüm mutant proteinlerin MDCK hücreleri ve Xenopus laevis oosit ifade sisteminde yabanıl tipe göre farklı oranlarda fonksiyon değişikliği gösterdiği belirlenmiştir. Anahtar kelimeler: Diabetes insipidus, AQP2, Fonksiyonel analiz