Dişi farelerde bisfenol M ile oluşturulmuş karaciğer hasarının incelenmesi

Plastik üretiminde ve kullanımındaki önemli artış, plastik bileşenlerinin çevre ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel toksik etkilerine yönelik endişeleri beraberinde getirmiştir. Bu bağlamda, plastik sanayisinde yaygın kullanılan bisfenol türevleri özel bir ilgi alanı oluşturmaktadır. Bisfenol A (BPA), bilinen bir endokrin bozucu kimyasaldır. Hormonal yapıyı bozarak endokrin sistemin işleyişinde sorunlara yol açtığı, çeşitli dokularda hasarlar yarattığı, oksidatif stres ve hücresel hasar gibi mekanizmalarla birçok organ sisteminde toksisiteye neden olduğu bildirilmiştir. BPA'nın toksik etkileri nedeniyle bazı ülkelerde kullanımına getirilen kısıtlamalar sonucunda, BPA analoglarının kullanımında bir artış gözlenmiştir. Bisfenol M (BPM), bu analoglardan biridir. Kimyasal yapılarının BPA'ya benzer olması nedeniyle bisfenol analoglarının da benzer toksikolojik özelliklere sahip olabileceği endişeleri bulunmaktadır. BPM'nin de östrojenik ve antiandrojenik aktivite gösterebildiği belirtilmiştir. Endüstriyel uygulamalarda, yapıştırıcılarda, kaplamalarda, epoksi reçinelerinde ve yüksek performanslı plastiklerde BPA alternatifi olarak artan kullanımı, bu kimyasalın güvenlik profilinin daha detaylı araştırılması gerekliliğini ortaya koymaktadır. Ancak yapılan literatür araştırmalarında, BPM'nin toksikolojik etkileri üzerine yeterli sayıda bilimsel çalışma bulunmadığı belirlenmiştir. Özellikle BPM'nin memeli dokularında, insan sağlığı üzerindeki etkilerinin anlaşılması için uygun bir model organizma olan fareler üzerinde yeterli çalışma yapılmamıştır. İnsan vücudunda detoksifikasyon ve metabolizma süreçlerinin merkezinde yer alan karaciğer, yabancı bileşiklerin işlenmesinde birincil role sahip olması nedeniyle toksikolojik çalışmalar için önemli bir hedef organdır. Bu tez çalışmasında, BPM'nin karaciğer dokusunda oluşturduğu histopatolojik, biyokimyasal ve moleküler değişikliklerin incelenmesi amaçlanmıştır. BPM'nin biyolojik etkileri ve toksikolojik profili hakkında daha fazla bilgi edinmek, çevresel ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel etkilerini değerlendirmek açısından büyük önem taşımaktadır. Bu tez çalışmasında, BPM'nin karaciğer üzerindeki potansiyel toksik etkilerini değerlendirmek için deneysel bir fare modeli kullanılmıştır. Sakarya Üniversitesi Deney Hayvanları Merkezi'nden temin edilen 6 haftalık dişi BALB/c fareler kullanılmıştır. Toplam 28 adet fare, her birinde 7 fare olacak şekilde rastgele 4 gruba ayrılmıştır: bir kontrol grubu ve üç deney grubu. Kontrol grubuna çözücü madde olarak %1 Dimetil Sülfoksit (DMSO) içeren serum fizyolojik uygulanmıştır. Deney gruplarına ise sırasıyla 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ve 10 mg/kg dozlarında BPM, 14 gün boyunca her gün intraperitoneal olarak uygulanmıştır. BPM maddesi, %99 saflık derecesinde Sigma firmasından temin edilmiş ve DMSO içinde çözdürülerek serum fizyolojik ile seyreltilmiştir. Fareler standart oda koşullarında barındırılmış ve beslenmiştir. Uygulama süresi sonunda tüm hayvanlar anestezi altında sakrifiye edilerek karaciğer dokuları çıkarılmıştır. Karaciğer dokuları, histopatolojik inceleme için rutin işlemlere tabi tutulmuştur. Doku kesitleri Hematoksilen-Eozin (H&E) ile genel doku morfolojisi ve Masson Trikrom ile kollajen birikimi (fibrozis) için boyanmış, ışık mikroskobunda incelenmiştir. Elektron mikroskobu incelemeleri için doku parçaları glutaraldehit ve Osmiyum Tetroksit ile fikse edilmiş, epona gömülmüştür. Ultra-ince kesitler Uranil asetat ve Kurşun sitrat ile boyanmış ve Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM) altında ultrastrüktürel değişiklikler incelenmiştir. Uygulama sonrası alınan karaciğer doku örnekleri -80°C'de saklanmıştır. Karaciğer dokusundan yapılan protein izolasyonlarının ardından ELISA yöntemi ile karaciğer hasar belirteci enzimleri olan AST ve ALT düzeyleri, inflamatuvar yanıtla ilişkili IL-6 ve TNF-α ile mitokondriyal bütünlüğü gösteren sitokrom c protein miktarları belirlenmiştir. Moleküler düzeydeki değişiklikleri belirlemek amacıyla ise karaciğer dokusu örneklerinden total RNA izolasyonu yapılmış, ardından cDNA sentezi gerçekleştirilmiştir. RT-PCR yöntemi ile apoptozla ilişkili genlerin (Bax, Bcl-2, kaspaz-3, p53) mRNA ifade düzeyleri belirlenmiştir. Çalışmanın sonuçları, kontrol grubu farelerin karaciğer dokusunda herhangi bir patolojik lezyon bulunmadığını, dokuların normal yapıda olduğunu göstermiştir. Kontrol grubunda hepatositler normal özellikler sergilemiş, hepatik plaklar düzenli, sinüzoid boşluklar normal genişlikte bulunmuş ve anormal kollajen birikimine rastlanmamıştır. BPM uygulanan deney gruplarında ise doz artışına bağlı olarak karaciğer dokusunda çeşitli, doza bağımlı histopatolojik değişiklikler gözlenmiştir. Bu etkiler hücresel dejenerasyon (belirgin hidropik dejenerasyon, sitoplazmik vakuolizasyon, karyomegali, nükleer pleomorfizm, sitoplazmanın buzlu cam görünümü, hücre boyutlarında artış), hücre ölümü (nekrotik alanlar, apoptoz, apoptotik cisimcik oluşumu,), inflamasyon (mononükleer hücre infiltrasyonu) ve fibrozis (postnekrotik fibrozis, Disse aralığında kolajen birikimi) şeklindedir. Ayrıca hepatositlerin normal ışınsal dizilimlerinde bozulma, hücre plaklarında düzensizlik ve sinüzoidlerde genişleme (dilatasyon) gibi yapısal bozulmalar saptanmıştır. Safra kanaliküllerinde de dejeneratif değişiklikler izlenmiştir. Artan dozla birlikte hepatositlerin ışınsal dizilimlerindeki bozulmalar, karyomegali ve nekrotik alan çapları artmıştır. Ultrastrüktürel incelemelerde, BPM maruziyetinin karaciğer hepatositlerinde mitokondri merkezli, doza bağımlı olarak artan organel düzeyinde hasara yol açtığı saptanmıştır. Mitokondrilerde yaygın şişme, deformasyon, kristalarda bozulmalar (kristolizis), krista kaybı ve membran bütünlüğünde bozulmalar gözlenmiştir. Bu değişiklikler, BPM'ye bağlı mitokondriyal stres, enerji metabolizmasında bozulma ve disfonksiyonu yansıtmaktadır. Sitoplazmada çok katmanlı miyelin figürleri (bozulan lipid metabolizması ve artmış otofajik aktivite ile ilişkili), belirgin veya yaygın vakuolizasyon, serbest ribozom sayısında azalma ve lipid damlacıkları gözlenmiştir. Granüllü endoplazmik retikulumda (GER) yapısal düzensizlikler, dilatasyon ve parçalanma izlenmiştir; bu durum protein sentezi ve hücresel homeostazın etkilendiğini göstermektedir. Mitokondri ile GER arasındaki mesafenin azalması organel etkileşimlerinin değiştiğini göstermiştir. Çekirdeklerde dağınık kromatin dağılımı dikkat çekmiş, bu durum dejeneratif süreçlerin nükleer düzeyde de etkin olduğunu göstermiştir. Disse aralığında kolajen fibrilleri birikimi izlenmiştir. Elde edilen ultrastrüktürel bulgular, BPM'nin hepatositlerde apoptoz ve dejeneratif süreçleri tetikleyebileceğini göstermektedir. ELISA analizlerinden elde edilen bulgular doğrultusunda, ALT ve AST düzeylerinde düşük ve orta dozlarda anlamlı değişiklik gözlenmezken, yüksek doz BPM (10 mg/kg) uygulanan grupta ALT düzeyinde kontrol grubuna kıyasla anlamlı bir azalma saptanmıştır. Sitokin analizlerinde ise tüm deney gruplarında TNF-α düzeylerinde anlamlı artışlar belirlenmiş ve özellikle 2,5 mg/kg BPM uygulanan grupta bu artış en belirgin şekilde izlenmiştir. Aynı grupta IL-6 düzeyinde hafif fakat anlamlı bir azalma tespit edilmiş, diğer doz gruplarında IL-6 düzeylerinde anlamlı dalgalanmalar gözlenmiştir. Sitokrom C düzeyleri açısından değerlendirildiğinde, 2,5 mg/kg grubunda anlamlı bir azalma, 10 mg/kg grubunda ise anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu bulgular, BPM uygulamasının doz bağımlı olarak karaciğer hasarıyla ilişkili biyokimyasal parametrelerde değişimlere neden olduğunu göstermektedir. RT-PCR analizleri sonucunda, tüm doz gruplarında apoptozla ilişkili genlerin ekspresyon düzeylerinde doza bağlı değişiklikler saptanmıştır. Hücresel stres yanıtında kritik rol oynayan p53 geninin ekspresyonu, 10 mg/kg dozunda anlamlı düzeyde yükselerek 28,57 kata ulaşmıştır. Pro-apoptotik bir gen olan Bax, düşük ve orta dozlarda azalmış, ancak 10 mg/kg dozunda 2,38 kat artış göstermiştir. Anti apoptotik özellik gösteren Bcl-2 geninin ekspresyonu tüm dozlarda artmış, ancak en yüksek artış 10 mg/kg dozunda (85,84 kat) gözlenmiştir. Apoptozun efektör aşamasında görev alan Kaspaz-3 geninin ekspresyon düzeyleri dozla paralel olarak artış göstermiş ve 10 mg/kg dozunda 27,98 kat yükselmiştir. Bu bulgular, BPM'nin yüksek doz uygulamalarında hücresel stres, apoptoz ve hayatta kalma mekanizmalarında güçlü bir genetik yanıt oluşturduğunu göstermektedir. Elde edilen bulgular, literatürde bildirilen diğer bisfenol türlerinin (BPA, BPS, BPF, BPAF, BHPF, BPAF) çeşitli hayvan modellerinde karaciğer üzerinde neden olduğu toksik etkilerle büyük ölçüde paralellik göstermektedir. Diğer bisfenollerin de karaciğerde vakuolizasyon, dejenere hepatositler, sinüzoidal dilatasyon, inflamatuar hücre infiltrasyonu, nekroz, fibrozis, steatoz, apoptoz, mitokondriyal disfonksiyon gibi benzer histopatolojik ve hücresel hasarlara yol açtığı rapor edilmiştir. Sonuç olarak, bu tez çalışması Bisfenol M'nin fare karaciğer dokusu üzerinde doza bağımlı toksik etkiler oluşturduğunu ortaya koymuştur. Histopatolojik ve ultrastrüktürel bulgularla desteklenen bu etkiler; hücresel dejenerasyon, inflamasyon, apoptoz ve yapısal bozulmalar şeklinde kendini göstermiştir. ELISA analizleri, yüksek doz BPM uygulamasında ALT düzeyinde anlamlı bir azalma ve TNF-α düzeylerinde tüm doz gruplarında anlamlı artış olduğunu ortaya koymuştur. IL-6 ve sitokrom c düzeylerindeki anlamlı dalgalanmalar, BPM'nin inflamatuar yanıt ve mitokondriyal stres üzerinde etkili olduğunu göstermektedir. RT-PCR analizleri, yüksek doz BPM'nin p53, Bax ve kaspaz-3 gen ekspresyonlarını anlamlı düzeyde artırarak apoptozu indüklediğini; aynı zamanda Bcl-2 geninde dikkate değer bir artış oluşturarak hücrelerin hayatta kalma yanıtını da aktive ettiğini ortaya koymuştur. Bu bulgular, BPM'nin hücresel stres, apoptoz ve inflamasyon mekanizmaları üzerinde güçlü bir genetik ve biyokimyasal etki yarattığını göstermektedir. Çalışmanın elde ettiği veriler, BPM'nin toksikolojik profiline dair veriler sunarak, bu kimyasalın kullanımına yönelik potansiyel düzenlemeler ve risk değerlendirmeleri için bilimsel temel oluşturmaya katkı sağlamaktadır. Bu kapsamda, BPM'nin insan sağlığı üzerindeki etkilerini daha kapsamlı değerlendirebilmek adına ileri düzey çalışmalara ihtiyaç duyulduğu vurgulanmıştır.