Determining the effects of DOT1L interacting proteins on cellular reprogramming

Tamamen farklılaşmış hücreler ektopik transkripsiyon faktörleri ile uyarılmış plüripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlanabilmektedir. Fakat bu hücre kaderi değişiminin arkasında yatan mekanizma hala tam olarak açıklanamamıştır. Embriyonik gelişim sürecinde olduğu gibi somatik hücre yeniden programlanmasında da epigenetik düzenleyicilerin büyük rolü bulunmaktadır. Bundan önce, Histon H3 lizin 79 metiltransferazı olan DOT1L'in susturulması durumunun, soya özgü genleri düzenleyerek yeniden programlama verimini arttırdığı gösterilmiştir. DOT1L, kromatine çağırılarak bir dizi diğer kromatin düzenleyiciler ile uyum halinde hareket etmektedir. Fakat bu tip DOT1L-etkileşimli proteinlerin yeniden programlama üzerindeki rolü halen bilinmemektedir. Bu tezin ilk kısmında, DOT1L-yakınsal proteinleri biyotinlemekle görevli, seçici olmayan BirA ligazı (BirA*) içeren BioID metodu kullanılarak; özgün DOT1L-etkileşimli proteinler in vivo olarak belirlenmiştir. Biyotinlenen proteinler Streptavidin ile çöktürülüp LC-MS/MS ile tanılanmıştır. Elde edilen özgün DOT1L-etkileşimli protein adaylarının yeniden programlama üzerindeki etkileri incelenmiştir. İnsan fibroblast hücrelerinde shRNA'lar ile aday genlerin ifadeleri baskılanıp bu hücreler yeniden programlanmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar, AF10'un (MLLT10) baskılanmasının uPKH oluşum verimini arttırdığını ve yeniden programlama üzerinde DOT1L'e benzer şekilde bariyer görevi olduğunu göstermektedir. Bu bulgu, CRISPR/Cas9-aracılığıyla AF10'un susturulması ile de doğrulanmıştır. DOT1L-baskılanması ve AF10-susturulması durumlarının bir arada uygulanmasıyla, ek bir artışın görülmemesi, bu iki kromatin faktörünün aynı yolakta etkili olduğunu akla getirmektedir. Bu tezin ikinci kısmında, bilinen DOT1L'e doğrudan ve işlevsel bağlanan proteinler literatürden belirlenerek, bu genlerin yeniden programlama üzerindeki etkileri işlevsel kayıp deneyleri ile incelenmiştir. RNA interferans veya CRISPR/Cas9 ile Mixed Lineage Leukemia (MLL1) ifadesinin baskılanması yeniden programlama verimini arttırmıştır. MLL1'in yeniden programlamayı nasıl engellediğini belirlemek için, RNA-dizileme analizi yapılmıştır. MLL1'in baskılanması fibroblastlara-özgü genlerin baskılanması ve plüripotentlere-özgü genlerin etkinleşme hızında ivmelenme ile sonuçlanmıştır. Bir arada ele alındığında, bu çalışma iki önemli kromatin belirleyicisinin yeniden programlama üzerinde bariyer olarak davrandığını ortaya çıkarmış ve hücre kimliğinin devamlılığını sağlayan epigenetik mekanizmaları anlamamıza katkı sağlamıştır.