Construction and characterization of Arg16phe and Asp19leu mutations on bile salt hydrolase enzyme isolated from Lactobacillus plantarum in e.Coli

Kardiyovasküler hastalıkların temel sebebi olarak gösterilen yüksek kolesterol seviyesinin düşürülmesinde probiyotiklerin önemli role sahip oldukları düşünülmektedir. Tedavi için kullanılan ilaçların pahalı ve çok fazla yan etkilerinin olması probiyotiklerin önemini artırmaktadır. Probiyotiklerin özellikle bağırsak bakterilerindeki Lactobacillus ve Bifidobacterium'un Safra Tuzu Hidrolaz (STH) enzimi ile kolesterol miktarını düşürdüğünü gösteren birçok çalışma bulunmaktadır ancak STH enzimi hakkında yeterince bilgimiz yoktur. STH enzimini karakterize etmek için kullanılan metotlardan biri yönlendirilmiş mutagenez yöntemi, diğeri de kristalografidir. Bununla birlikte, literatürde Cys2 aminoasiti dışında STH enzimi ile ilgili mutagenez çalışması bulunmamaktadır. Bu çalışmada, Lactobacillus plantarum türündeki tamamen korunmuş olan Arg-16 ve Asp-19 aminoasitleri uygun primerler kullanılarak pCON1 konstraktı içinde sırasıyla fenilalanin ve lösin aminoasitlerine dönüştürülmüştür. Daha sonra da mutant bsh genleri, pET22b ekspresyon vektörüne aktarılmıştır. Rekombinant mutant proteinler Ni2+ temelli kolon kullanılarak saflaştırılmış ve sonra da aktiteleri ve yapısı sırasıyla direk besi yeri ve ninhidrin testleri ile ve poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. Direk besiyeri ve Ninhidrin test sonuçları, tüm mutasyonların enzim inaktivasyonu ile sonuçlandığını gösterirken, poliakrilamid jel elektroforez sonuçları, Arg-16 mutant BSH proteinin katlandığını, ancak Asp-19 mutant proteinin katlanmadığını göstermiştir. Elde edilen sonuçlar; Arg-16 aminoasidinin BSH enziminin katalitik aktivitesinden sorumlu olduğunu, ortaya koyarken, Asp-19 aminoasitinin ise BSH enziminin katlanması ve stabilitesi için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu çalışma; BSH enziminin, özellikle katalitik aktiviteden ve safra tuzlarına olan özgüllüğünden sorumlu olduğu varsayılan aminoasitler üzerinde daha fazla yönlendirilmiş mutagenez çalışmalarının gerekli olduğunu ortaya koymaktadır.