Making use of synthetic biology toolbox for industrial biotechnology applications: The case of enzyme production

Mikroorganizmalar endüstriyel açıdan önemli enzimlerin üretimi için uzun yıllardır kullanılmaktadır. Ancak verim ve çeşitlilik mikroorganizmanın doğal kapasitesiyle sınırlı olduğundan artan ihtiyaca yeterince cevap verememektedir. Bu noktada rekombinant DNA teknolojisi alternatif çözümler sunmaktadır. Rekombinant DNA teknolojisi yöntemlerine kıyasla, standardize edilmiş parçaların ve protokollerin kullanımını mümkün hale getiren sentetik biyoloji yaklaşımı ise endüstriyel biyoteknoloji alanında yaygın olarak kullanılmaya başlamıştır. Sentetik biyolojinin odağında sadece promotör, kodlayıcı bölge gibi DNA parçalarının ve yolak gibi metabolik kimyasal reaksiyonların bütünleşik tasarımı değil, aynı zamanda mikroorganizmanın kendisinin de tasarlanması yani "konakçı tasarımı" da bulunmaktadır. Bu tasarımlar, hücrelerin doğal ürünlerini daha fazla üretme, heterolog üretim, ürünü daha uzun süre stabil tutma ya da alternatif karbon kaynaklarının üretimde kullanımı çalışmalarındaki zorlukların giderilmesini amaçlamaktadır. Bu tez, endüstriyel olarak anlamlı fungusta ve mayada suş geliştirme çalışmalarına yönelik sentetik biyoloji uygulamalarını içermektedir. İlk bölümde, bilinen filamentli funguslardan Aspergillus brasiliensis konakçı olarak kullanılmış ve proteaz-eksik hale getirilmiştir. Oluşturulan suş, doğal ya da heterolog ürettiği enzimlerin daha uzun süre bozunmaya uğramadan stabil kalmasını sağlamıştır. Bunun yanı sıra, karbon katabolit represyon alanında promotör mühendisliği çalışmaları yapılmış, glukoamilaz promotörü üzerinde karbon katabolit represyonu giderecek şekilde baz ekleme/silme gerçekleştirilmiştir. 3 farklı promotör elde edilmiş ve ksiloz varlığında aktivite göstermeye devam eden varyant, proteaz-eksik suşta heterolog enzim ifadesi için promotör olarak kullanılmıştır. Sonuçta, lignoselülozik bir karbon kaynağı varlığında heterolog enzim üretimi gerçekleştirilmiş, enzimin aktivitesi fermantasyon boyunca sabit tutulmuş ve bu suşta farklı karbon kaynaklarının eşzamanlı kullanımı sağlanmıştır. İkinci bölümde, Saccharomyces cerevisiae mayasında gen silme çalışmaları için CRISPR/Cas9 sistemi geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu bağlamda, beta-izopropilmalat dehidrojenaz geni, LEU2, hedeflenmiş, ilgili kılavuz RNA tasarlanmış, Golden Gate montajı ile bir CRISPR plazmidi oluşturulmuştur. Sonuçta, mayada işlevsel bir CRISPR/Cas9 sisteminin oluşturulması ve kullanımı doğrulanmıştır.