Digitalis ferruginea bitkiside alternatif oksidaz genlerinin fonksiyonel karakterizasyonun yapılması ve sekonder metabolit üretimi ile ilişkisinin incelenmes

Alternatif oksidazlar (AOX) bitki mitokondriyal elektron taşıma zincirinde terminal oksidazlardan biri olarak görev alırlar. Mitokondriyal retrograd sinyalleşmede anahtar bir rol oynamalarının yanısıra, bitkilerde stres durumunda sinyal iletimine yardımcı olma işlevleriyle de çok iyi bilinirler. Sesil bir organizma olarak bitkiler, çeşitli çevresel streslere maruz kalırlar ve bu streslerle savaşmak için ikincil metabolizmaları sayesinde metabolitler üreterek kendilerini stres koşullarına adapte ederler. Digitalis ferruginea L., ikincil metabolizması neticesinde ürettiği metabolitler (özellikle kardenolitler) sebebi le oldukça popüler bir bitkidir. Bu tezde, D. ferruginea' dan elde edilen, farklılaşmamış kallus süspansiyon kültüründe, ikincil metabolit üretimi ile alternatif oksidaz aktivitesi arasındaki ilişki değerlendirilmiştir. D. ferruginea'ya ait üç AOX geni transkriptom verileri kullanılarak belirlenmiştir. Belirlenen genlerin, Fonksiyonları terminal oksidaz olarak karakterize edilmiş ve varsayılan protein dizilerinin yapısal özellikleri, in silico analizleri biyoinformatik yöntemler kullanılarak birbirleriyle karşılaştırılmıştır. İlgili genler, RT-PCR yöntemi kullanılarak coğaltılmışlardır. Belirlenen ve doğrulanan dfsAOX genleri daha sonra Gateway klonlama yöntemi kullanılarak S. cerevisiae'ye aktarılmıştır. Rekombinant S. cerevisiae hücreleri, RT-PCR, Western-blot, Spot Assay ve Confocal mikroskopi yöntemleri kullanılarak heterologous protein ekspresyon kapasiteleri açısından araştırılmıştır. Daha sonra hazırlanan kallus süspansiyon kültürleri SHAM, SA ve AA ile muamele edilerek ikincil metabolit birikimleri, dfsAOX ve dfsPAL gen ekspresyon çalışmaları incelenmiştir. Sonuçlara bir bütün olarak bakıldığında AOX' un bitkilerde sekonder metabolit birikiminde düzenleyici bir rol oynayabileceği ancak bu yorumu doğrulamak için daha ileri analizlere ihtiyaç duyulacağı anlaşılmaktadır.