P.Ser420Phe CRY2 varyantının işlevsel karakterizasyonu

Sirkadiyen saat, organizmaların çevrenin ritmik değişikliklerine uyum sağlamasını sağlayan doğuştan gelen bir mekanizmadır. Memeli hücrelerinde bu mekanizma, dört çekirdek saat proteininin (CRY'lar, PER'ler, CLOCK ve BMAL1) etkileşimi ile sağlanır. İnsan saat geni varyasyonları, uyku, metabolizma, bağımlılık, nörolojik bozukluklar ve endokrin ve metabolik gibi çok sayıda davranışsal ve fizyolojik hastalık ile ilişkilidir. Ancak moleküler seviyedeki varyasyonların olası etkileri hakkında çok az şey bilinmektedir, bu varyasyonların fonksiyonel sonuçları ve hastalıkla olan ilişkileri belirsizliğini korumaktadır. Bununla birlikte, varyantların fonksiyonel analizleri, proteinlerin yapısı ve işlevindeki rolünü anlamamıza yardımcı olur. Bu çalışmada 1000 Genom Projesinden ve Ensembl veri tabanından nadir CRY2 varyantları belirlendi. Varyantlar, silikonda araçlar kullanılarak patojenite tahminine dayalı olarak seçildi. CRY2 proteininin 3 boyutlu yapısı kullanılarak, alfa heliks yakınında bulunan varyant (p.Ser420Phe CRY2) fonksiyonel olarak karakterize edildi. p.Ser420Phe CRY2'nin CLOCK/BMAL1 güdümlü transkripsiyonda baskılama aktivitesini azalttığını ve Cry1-/-Cry2-/- fare embriyonik fibroblast hücrelerinde vahşi tipten daha kısa bir süre ile kurtarılmış sirkadiyen ritim gösterdiğini bulduk. Ayrıca varyantın, diğer çekirdek saat proteinleri CLOCK ve PER2'ye afinitesinin azaldığını ve hücre çekirdeğine uygun şekilde lokalize edemediğini biyokimyasal çalışmalarımızla gösterdik. Dahası, stabilite deneyi sonuçları, p.Ser420Phe CRY2 varyantının kanonik olmayan bir mekanizma tarafından bozulduğunu gösterdi. Toplu olarak, sonuçlarımız alfa heliks bölgesinin CRY2'nin bozulmasında, diğer çekirdek saat proteinleri ile bağlanmasında ve ayrıca hücre çekirdeği lokalizasyonunda önemli bir rol oynadığını göstermektedir.