Repurposing trifluoperazine in combination with kinase inhibitors for glioblastoma therapy: insights from in vitro and larval zebrafish in vivo models

Gliomalar, düşük dereceli glioma ve glioblastoma olarak sınıflandırılır ve özellikle glioblastoma en agresif ve tedaviye en dirençli formu temsil ederek daha etkili terapötik stratejilere duyulan ihtiyacı ortaya koyar. Son zamanlarda, antipsikotik ilaç trifluoperazin, gliomlar da dahil olmak üzere birden fazla kanser türünde güçlü bir antikanser ajan olarak ön plana çıkmıştır. Önceki çalışmalarımız, trifluoperazinin; hepatoselüler karsinomda etkinliği kanıtlanmış çok hedefli bir kinaz inhibitörü olan sorafenib ile Hep3B hepatoma hücrelerinde güçlü bir terapötik kombinasyon oluşturduğunu göstermiştir. Bu çalışmada, U87-MG glioblastoma hücrelerinde trifluoperazinin tek başına veya sorafenib ile kombine edildiğinde yarattığı transkriptomik etki değerlendirilmiş ve kombinasyon tedavisinin; büyüme duraklaması, invazivitenin azalması ve metabolik stres ile hücresel kader yeniden programlamasına ait transkripsiyonel imzalarla karakterize edilen sinerjistik bir etki oluşturduğu ortaya konmuştur. Trifluoperazin tek başına uygulandığında, temel metabolik ve hücre döngüsü ile ilişkili genlerin artan ekspresyonuyla proliferatif bir profili teşvik ederken, sorafenib ile kombinasyonu bu etkileri baskılayıp onkojenik sinyal yolaklarını susturmuş ve tümör baskılayıcı yolları güçlendirmiştir. Bu bulgular, trifluoperazinin kinaz hedefli glioblastoma terapisi için yeniden amaçkandırma potansiyelini vurgulamakta ve direnç mekanizmalarının üstesinden gelmek için kombinatoryal stratejilerin önemini ortaya koymaktadır. Glioblastoma hücrelerinde sorafenib uygulaması trifluoperazin ile sinerjisi hakkında mekanistik bilgiler sağlamış olsa da, 2-5 günlük dönemde 72 saat süreyle zebrafish larvalarına yapılan in vivo maruziyetin şiddetli morfolojik bozukluklara yol açtığı gözlemlenmiştir. Ayrıca, Tg(gfap:GFP) hattı zebrafish larvaları kullanılarak gerçekleştirilen ön çalışmalardaki glial belirteç görüntüleme taramasında sorafenib, GFP floresansını belirgin şekilde azalttığı halde; trifluoperazinin tek başına her iki deneyde de herhangi bir advers etki göstermediği gözlemlenmiştir. Bu in vivo toksisite, trifluoperazinin kombinasyonunda kullanılmak üzere daha düşük toksisiteye sahip alternatif kinaz inhibitörlerinin araştırılmasını öncüllemiştir. U87-MG ve A172 hücrelerinde büyümeyi baskılayıcı etki gösteren diğer kinaz inhibitörleri MTT analizleriyle belirlenmiştir. Toplam 157 kinaz inhibitörünün taranması sonucunda her iki hücre hattında da IC50 değeri 5 μM'nin altında olan 12 inhibitör tespit edilmiştir. Tam sitotoksik etki gösteren en umut verici bileşikler arasında volasertib, INK128, CAY10626, tamatinib, Torin1, bisindolylmaleimide IX, AZD7762, NH125 ve BMS345541 yer almıştır. Trifluoperazin, seçilen bu inhibitörlerle kombinasyon halinde test edilmiş ve volasertib ile INK128'in anlamlı sinerji sergilediği belirlenmiştir. Öte yandan, tek başına güçlü inhibitör etkisi olan bazı bileşiklerin, trifluoperazin eklenmesiyle ters yönde etki ettiği gösterilmiştir. PLK1 inhibitörü volasertib, trifluoperazin ile kombinasyonundaki en yüksek sinerji skoru nedeniyle öncelikli olarak belirlenmiştir. Translasiyonel önemini araştırmak üzere U87‑MG hücrelerine 2,5 μM volasertib uygulanarak RNA‑seq analizi yapılmıştır. Elde edilen ilaca özgü gen imzası TCGA‑GBM kohortunda değerlendirilmiş, yüksek volasertib imza skorlarının anlamlı düzeyde artmış genel sağkalım ile ilişkili olduğu gösterilmiş, bu da gliblastoma tedavisinde trifluoperazin ile kombinasyonunun yeniden kullanım stratejisinin gerekçesini güçlendirmiştir. Son olarak, öncüllenmiş tekil veya kombinasyon tedavi protokollerinin erken larval toksisite profilleri değerlendirilmiş, hiçbirinin gelişimsel anormalliklere veya fenotipik toksisite belirtilerine yol açmadığı gözlemlenmiştir. Bu kapsamda, zebra balığı larvalarının karanlık:ışık alternasyonuna verdikleri lokomotor davranışı çok boyutlu şekilde analiz edebilen; ısı haritaları ile uyarana bağlı hız ve ivme analizlerini birleştiren bir R Shiny uygulaması olan LDexplore geliştirilmiştir. Bu uygulama, trifluoperazin'in tek başına veya volasertib ile kombinasyon halinde uygulanmasının larvaların lokomotor davranışa etkisi test etmek için kullanılmış ve bu kombinasyon tedavisinin ışığa bağlı irkilme tepkisini anlamlı şekilde bozmadığı saptanmıştır. Bu bulgular, trifluoperazin ve volasertib kombinasyonunun güçlü terapötik potansiyele sahip olduğunu ve zebra balığı larva deneyleriyle de desteklenen in vivo uygulanabilirlik sunduğunu göstermektedir. Ayrıca, daha düşük toksisiteye sahip ve glioblastoma hücre büyümesini anlamlı şekilde sinerjik olarak baskılayan diğer kinaz inhibitörleri de tanımlanmış olup, ileri araştırmalar için öncüllenmiştir. Anahtar Kelimeler: Glioblastoma, Kanser, İlaç Taraması, İlaç Yeniden Amaçlama, Zebra Balığı Larva Modeli, Trifluoperazin, Volasertib.