Glukozamin (GA) bağlı hyaluronik asit (HA) nanopartiküllerin (GA-nHA) geliştirilerek yapısal özelliklerinin belirlenmesi ve ın vıtro hücre kültüründeki etkilerinin araştırılması

Osteoartrit (OA) eklemde ağrı, hareket kısıtlılığı, deformite ve tedavi edilmediği taktirde sakatlığa ve ölüme yol açabilen eklem hastalığıdır. Hastalığın seyrini değiştiren glukozamin (GA) ve kondroitin sülfat (KS)'ın eklem kıkırdağını besleyen sinovyal sıvıya nasıl ulaştığı ve etkisini nasıl gösterdiği az bilinir. Çalışmanın araştırma soruları; (1) Hyaluronik asit (HA) nanopartikül (nHA) şeklinde geliştirilerek eklem içinde kontrollü ilaç salım sistemi olarak kullanılabilir mi? (2) GA, nHA kullanılarak eklem içine taşınabilir mi? (3) GA'lar nHA'lardan kontrollü bir şekilde salınır mı? (4) GA-nHA hücre yapışması ve çoğalmasını arttırabilir mi? (5) GA-nHA'lar kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (Kİ-MKH) kıkırdak hücresine farklılaşmasına pozitif yönde etki eder mi? (6) GA-nHA'lar sağlıklı ve OA'lı insan kıkırdak hücrelerinin ekstraselüler matriks sentezini artırıp OA işaretlerini azaltır mı? nHA üretildikten sonra yapısal özellikleri Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM), Dinamik Işık Saçılımı (DLS) ve Nükleer Manyetik Rezonans (¹H NMR) ile belirlenmiştir. nHA'ya GA ve KS bağlandıktan sonra bu moleküllerin salımı Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile ölçülmüştür. KS'in nHA'dan salınmadığı görüldüğü için deneyler GA ile sürdürülmüştür. 1, 10 ve 100 µg/ml GAnHA'ların kondrosarkoma (SW-1353) hücreleri üzerindeki etkisi WST-1 hücre ii proliferasyon testi ile ölçülmüştür. GA-nHA'nın Kİ-MKH üzerindeki erken kondrojenik farklılaşma işaretlerinden SRY-Box-9 (SOX-9) ve kıkırdak oligomerik matriks proteini (COMP) ifadelerinin üzerine etkisini ölçmek için RT-PCR yapılmıştır. GA-nHA'ların sağlıklı ve OA'lı kondrositler üzerindeki ekstraselüler matriks işaretleri olan tip II kollajen (COL2A1) ve COMP üzerine etkisi ve OA işareti olan matriks metalloproteinaz-13 (MMP-13) üzerindeki etkisi ise yine RTPCR ile değerlendirilmiştir. ¹H NMR sonuçlarındaki 0.6-5.0 ppm arasındaki pikler nHA'ların başarılı bir şekilde sentezlendiğini, SEM ve DLS sonuçları ise partiküllerin 200-600 nm boyutları arasında homojen dağıldığını göstermektedir. HPLC ile ölçülen salım sonuçlarıyla GA'ların nHA'lardan 21 günde %20 oranında salım yaptığı belirlenmiştir. WST-1 proliferasyon testi sonuçlarına göre GA-nHA'nın üç dozu da hücre proliferasyonunu kontrol grubuna göre anlamlı olarak artırmamıştır. Ancak, GA'yı tek başına hücrelere uygulamanın kontrol grubuna göre anlamlı olarak proliferasyonu artırdığını göstermiştir. GA-nHA kondrojenik farklılaşma işaretleri olan SOX-9 ve COMP ifadesini anlamlı olarak değiştirmemiştir. OA'lı kondrositlerde 1 µg/ml GA-nHA MMP-13 seviyesini düşürmüş, 10 µg/ml GA-nHA uygulaması ise MMP-13 seviyesini düşürürken COMP ve COL2A1 seviyelerinde artışa neden olmuş ancak istatistiksel fark bulunmamıştır. Sağlıklı kondrositlerde ise üç dozda GA-nHA uygulaması kontrol grubu ile karşılaştırıldığında MMP-13 ifadesini baskılamış ancak bu da istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. Tek başına GA uygulandığında ise MMP-13 seviyesi anlamlı olarak düşmüş , farklılaşma işareti olan COMP seviyesini ise anlamlı olarak yükseltmiştir. Tek başına 10 µg/ml HA uygulaması sağlıklı kondrositlerin COMP ve COL2A1 seviyesinde artış sağlasa da yine kontrol grubu ile istatistiksel olarak anlamlı fark yoktur. GA-nHA'ların hücre proliferasyonuna ve Kİ-MKH'lerin kondrojenik farklılaşmasında bir etkisi olmamakla beraber OA'lı kondrositlerde MMP-13 ifadesini düşürdüğü, COMP ve COL2A1 seviyesini artırdığı görülmüştür. Sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı olmasa da klinik olarak anlamlı olduğu düşünülmektedir. GA ve HA'yı tek başına uygulamalarda bazı olumlu sonuçlara ulaşmamız, GA-nHA'nın nanopartikül formunda hücrenin kullanamayacağı bir forma getirilmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. GA-nHA'ların OA tedavisinde etkili bir yöntem olup olmadığının belirlenebilmesi için hücre kültür ortamındaki dinamikleri, hücreye alım, hücrede işlenme mekanizmaları izlenmeli ve hücre kültüründeki etkileri uzun dönemde araştırılmalıdır.