Glutamic acid 358 is important for the normal allosteric function and heterotetramer formation of potato adp-glucose pyrophosphorylase

ADP-glükoz pirofosforilaz (AGPaz) bitki nişasta biyosentezinde rol alan anahtar bir enzimdir. Enzimin iki farklı gen tarafından kodlanan büyük (LS) ve küçük (SS) alt birimleri vardır. Deneysel ve hesaplamalı çalışmalar patates AGPase alt birimleri arası yüzey amino asitlerinin etkileşimlerinin, allosterizm için önemli olduğunu göstermiştir. Belirlenen amino asitler arasından; LS A91, F101, F311 ve E358?in (hataya yatkın PCR vasıtasıyla tanımlanmıştır) patates AGPazının allosterik ve katalitik özellikleri etkilediği bulunmuştur. Bu çalışmada, bu mutasyonların patates AGPazının heterotetramer oluşumu ve allosterik ve katalitik özelliklerine etkisi incelenmiştir. Tüm mutasyonlar, vahşi tip (WT) patates AGPase büyük alt birimi cDNA?sına noktasal mutasyon PCR?ı ile uygulanmıştır. WT-LS ile mutant LS?ler, glikojen üretiminde yetersiz olan E.coli glgC (patates SS cDNA?sını içeren) hücrelerine transform edilmiştir. LS-E358G dışındaki tüm LS mutantları E.coli glgC-hücrelerini tamamlamıştır. LS-E358G mutasyonunu, katalitik, allosterik ve yapısal özelliklere etkisini anlamak amacıyla, ayrıntılı biyokimyasal karakterizasyonu tabi tutulmuştur. Mutant AGPaz LS-E358G?nin daha fazla heterotetramere ve daha az monomere ve dimere sahip olduğu gözlenmiştir. WT AGPase ile karşılaştırıldığında, mutantın allosteric ve katalitik özellikleri belirgin biçimde değişmiştir. Mutantın aktivatörüne afinitesine azalmış ve inhibitör yönelik afinitesi artmıştır. İlginç bir şekilde, patates AGPase LS daha çok düzenleyici olarak rol almasına rağmen, bu mutasyonun patates AGPase enziminin katalitik performansını etkilediği bulunmuştur. Ters ve ileri yön aktivite deneyleri ATP ve ADP-glükoz olan afinitenin azaldığını belirlemiştir.