H-ras aktif hücrelerinin Fibronektin proteinine bağlanma yeteneklerinin incelenmesi

Ras proteini, aktif olduğu hücrelerde sinyal iletimi yollarının düzenlenmesinde, hücre büyümesi ve farklılaşmasında merkezi bir moleküldür. Ras uyarıcı döngünün aktifleşmesinin, çeşitli kanserlerin ilerlemesinde önemli bir etken olduğu bulunmuştur.Fibronektin, ekstraselüler matriksin glikoprotein ailesine ait yüksek moleküler kütleli bir proteinidir, hücre zarındaki spesifik integrin moleküllerine bağlanır. Fibronektin, hücre gelişimi, hücre farklılaşması, doku oluşumu, apoptoz gibi birçok hücresel olayda önemli etkiye sahiptir.Bu çalışmada, H-ras aktif sıçan embriyo fibroblast hücreleri (5RP7)'nin çoğalma oranının zamana bağlı olarak belirlenmesi, bu hücrelerin fibronektin proteinine bağlanma kapasitelerinin ve bu bağlanmanın hücre apoptozu üzerine etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.5RP7 hücrelerinin büyüme eğrisinin belirlenmesi için tripan mavisi ile boyama yöntemi, bu hücrelerin fibronektine bağlanma kapasitesinin belirlenmesi için MTT yöntemi kullanılmış, değişik konsantrasyonlardaki fibronektin'e bağlı hücrelerin apoptozunda kaspaz enzim aktivitesinin belirlenmesi için DNA parçalanma oranları ölçülmüştür.5RP7 hücre konsantrasyonları zamana bağlı olarak doğru orantılı artış göstermiştir, etki çalışmalarında kullanılmak üzere optimum hücre sayısı 12,5x104 olarak tespit edilmiştir. 5RP7 hücrelerinin fibronektin'e bağlanmalarının konsantrasyona bağlı değişim gösterdiği ve hücrelerin 30 ?g/ml fibronektin'e maksimal oranda bağlandığı gösterilmiştir. Buna karşın, 30 ?g/ml fibronektin'e bağlanan hücrelerin apoptoza gitmediği, 10 ?g/ml fibronektin'e bağlanan 5RP7 hücrelerininse apoptoza giderek apoptotik DNA belirteci görüntüsüne paralel görüntü verdiği gösterilmiştir. Kaspaz-3 ve kaspaz-9'un fibronektin'e bağlı 5RP7 hücre apoptozu üzerindeki etkileri bu enzimlere spesifik inhibitörlerin eklenmesiyle araştırılmıştır. Kaspaz-3 ve kaspaz-9 inhibisyonunun fibronektin'e bağlı 5RP7 hücre DNA parçalanma oranını azalttığı belirlenmiştir. Sonuç olarak 5RP7 hücrelerinin fibronektin'e bağlı apoptoz mekanizmasının, mitokondrial yolaktan ya da endoplazmik retukuluma bağlı [Ca]+2 artışı sonucunda kaspaz-12 ve daha sonra kaspaz-9'un aktivasyonuna bağlı olduğu düşünülmektedir.