Hepatit B virus genotiplerinin S geninin nükleotid dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile belirlenmesi

1. ÖZET Hepatit B virus genotiplerinin S geninin nükleotid dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile belirlenmesi Anahtar Sözcükler : HBV, Genotip, PZT, RFLP Hepatit B virus (HBV) infeksiyonları ülkemiz açısından önemli bir sağlık sorunu olmasına karşın, genotip dağılımına ilişkin yeterli veri yoktur. Bu tez çalışmasında, laboratuvarımızda HBV-DNA olumlu bulunan 23 örnekte DNA dizi analizi ve RFLP yöntemleri ile genotiplendirme yapılmıştır. Bu amaçla serum örneklerinden proteinaz - K / fenol- kloroform yöntemi ile ekstrakte edilen HBV-DNA dizileri " S " genine özgü öncüller kullanılarak PZT yöntemi ile çoğaltıldı. Toplam 541 nükleotidlik bir bölgenin (256-796) çoğaltıldığı bu tepkimenin analitik duyarlılığı 19 kopya /mL olarak belirlendi. Etanol çökeltme yöntemi ile saflaştırılan PZT ürünleri "Sequitherm Excel II DNA Sequencing" kiri ve LI-COR dizileme aygıtı kullanılarak dizilendi. Bu yolla 356 ile 775. pozisyonlar arasında kalan 420 bazlık diziler elde edildi. Bu diziler, Gen-Bank'ten elde edilen ve genotipleri belli diziler ile evrimsel uzaklıkları açısından karşılaştırılarak, "Neighbour- Joining" yöntemi ile filogenetik ağaç oluşturuldu. Bu analiz sonucu, incelenen 23 örneğin tamamının genotip D içinde kümelendiği görüldü. Bilgisayar yardımı ile diziler aminoasit koduna çevrilerek HBsAg subtipleri belirlendi. Yirmibir örnekte ayw2, iki örnekte ise ayw3'e uyan diziler saptandı. Diğer yandan, dizileme yaklaşımlarının zaman alıcı ve pahalı olması gözönüne alınarak epidemiyolojik çalışmalara uygun, hızlı ve kolay uygulanabilir bir RFLP yöntemi geliştirildi. Bu amaçla Gen-Bank'ten elde edilen ve genotipleri belli 68 HBV-DNA dizisinde 256-796. pozisyonlar arasındaki bölgenin restriksiyon haritalaması yapıldı. Elde edilen veriler ışığında Mva I, Rsa I ve Hinf I enzimlerinin tek ve birarada kullanılması ile oluşan restriksiyon kalıplan belirlendi. Çalışmaya alman 23 serum örneğinin tamamında genotip D'ye özgün kalıplar saptandı.