Analysis of cell surface reorganization during cell division

Plazma zarı, hücrenin temel bileşenlerinden biridir ve gelişim, sinyal iletimi, iletişim gibi birçok hücresel olayda önemli rol oynar. Bu nedenle plazma zarında meydana gelen değişiklikleri anlamak, bu hücresel olayların işleyişini anlamak için kritik öneme sahiptir. Hücre bölünmesi, plazma zarının fiziksel olarak yeniden düzenlendiği kilit süreçlerden birdir ancak bu düzenlemelerin ardındaki biyokimyasal regülasyonlar hala aydınlatılmayı beklemektedir. Kütle spektrometresi (MS) temelli analizler, plazma zarı proteinlerinin tanımlanması ve hücre yüzey proteomundaki değişikliklerin niceliksel takibinin yapılabilmesi için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak yüzey proteinlerin görece az miktarı, MS temelli analizlerin uygulanabilirliğini kısıtlamaktadır. Bu nedenle, hücre yüzey proteinlerin izolasyon verimliliğini arttırabilecek yeni yöntemlerin geliştirilmesi bir gerekliliktir. Tezimin ilk bölümünde, hücre yüzey proteinlerinin zenginleştirilmesi için alternatif bir yaklaşım geliştirdim. Bu yöntemde, proteinlerdeki karboksilik asit grupları, karboksil-reaktif bir biyotin bileşiği ile işaretlenmekte ve biyotin-streptavidin çekimi kullanılarak izole edilebilmektedir. Geliştirdiğim bu yeni yöntemi, yüzey proteini izolasyonu için halihazırda kabul gören bir yöntem olan amin-reaktif işaretleme yöntemi ile SILAC (hücre kültüründe aminoasitleri izotop ile etiketleme) metodu kullanarak kıyasladım. Yaptığım niceliksel kıyaslamaya göre, karboksil-reaktif işaretleme yöntemi başarılı bir şekilde hücre yüzey proteinleri zenginleştirebilmektedir ve amin-reaktif işaretleme yöntemine alternatif/tamamlayıcı olarak kullanılabilir. Tezimin ikinci kısmında, daha önce mitoz-sipesifik yüzey lokalizasyonu gösterdiğini belirlediğimiz iki protein; PCDH7 ve PCDH1'e yoğunlaştım. Bu proteinlerin nasıl hücre-döngüsüne bağlı bir şekilde yüzeye gittiklerini anlamaya ve hücre bölünmesi sırasındaki rollerini belirlemeye çalıştım. Yakınlığa-bağlı biyotinleme yöntemi kullanarak, mitoz-spesifik hücre yüzey lokalizasyonunun olası mekanizmasını ortaya çıkardım. CRISPR-Cas9 sistemi kullanılarak PCDH7 protein seviyesi azaltıldığında hücre bölünmesinde anormallikler meydana gelmektedir. Bu durum, PCDH7'nin hücre bölünmesi için önemli bir rolü olduğunu işaret etmektedir.