The development of prophylactic and therapeutic vaccine using cell derived extracellular vesicles

Bu tezin temel amacı, kanser tedavisine karşı profilaktik ve terapötik bir taşıyıcı olarak, dıştan yüklenmiş olan hücre hattından ve tümör hattından üretilmiş eksozomların in vivo uygulanabilirliğinin genişletilmesidir. 30 ila 150 nm arasında bir boyuta sahip eksozomlar, her tür memeli hücresi tarafından salgılanan küçük hücre dışı keseciklerdir. Eksozomlar lipidler, nükleik asitler, metabolitler ve proteinler gibi biyoaktif kargoları aracılığıyla yeni bir hücreler arası iletişim moduna aracılık ederler. Eksozomlar, doğal dağıtım yeteneklerini kullanarak kanser tedavisinde immün terapötik nano taşıyıcılar olarak başarılı bir şekilde hizmet etmektedirler. Ayrıca, eksozomlar dolaşımdaki kararlılıkları, biyouyumlulukları ve düşük toksisiteleri nedeniyle bir dağıtım sistemi olarak ilgi çekicidirler. Bu tezin ilk bölümünde, terapötik bir murin melanom kanser aşısı geliştirmek için eksozomları bir nano taşıyıcı sistem olarak kullandık. Eksozomları CpG ODN, model antijen OVA ve lipidik ligand alfa-galaktosilseramid (aGC) ile liyofilizasyon yöntemi sayesinde başarıyla yükledik. Liyofilizasyonun hücre hattından üretilmiş eksozomlar üzerindeki etkisini akış sitometrisi, qNano, taramalı elektron mikroskobu ve western blot yöntemi ile analiz ettik. Liyofilizasyonun eksozomların veziküller bütünlüğüne ve temel biyolojik özelliklerine zarar vermediğini bulduk. Ayrıca, fare PEC, mezenterik lenf düğümü ve dalak hücrelerinde yüklenmiş eksozomların biyolojik dağılımını ve bağışıklık hücrelerini aktive etme kapasitesini test ettik. Yüklü eksozomların çoğunlukla antijen sunan hücreler (APC) tarafından alındığını gösterdik. Ayrıca, CpG ODN'nin eksozomlara yüklenmesinin makrofajlarda, B hücrelerinde ve dendritik hücreler' de (DC) APC aktivasyon belirteçlerini önemli ölçüde artırdığını ve fare mezenterik lenf düğümü ve splenositlerinden önemli ölçüde IFNy üretimini indüklediğini gösterdik. Son olarak, B16F10-OVA melanom tümörü taşıyan farelerde, CpG ODN, OVA ve aGC yüklü eksozomların terapötik etkisini test ettik. Üçlü (CpG ODN, OVA ve aGC) ligand yüklü eksozomlarla terapötik aşılamanın, farelerde yerleşik melanom tümörlerinin ilerlemesini baskıladığını bulduk. Ayrıca, üçlü ligand yüklü eksozomlar, Th-1 destekli anti-IgG OVA bağışıklığını tetikledi ve tümör mikro çevresindeki bağışıklık hücrelerini tümör baskılayıcı fenotipe dönüştürdü. Bu tezin ikinci bölümünde, immün terapötik bir kanser aşısı olarak tümör kaynaklı eksozomlar (TEX'ler) kullandık. Bu hücre dışı kesecikler doğal zengin tümör antijen rezervuarlarına sahiptir. Zayıf veya sınırlı bağışıklık oluşturma gibi istenmeyen özellikleri ve tümör hücreleri arasındaki iletişime aracılık ederek kanser gelişimini kolaylaştırması nedeniyle, TEX'ler güçlü hümoral ve hücre aracılı tümöre özgü bağışıklık tepkisini başlatan etkili bir immün adjuvan dağıtım sistemine dönüştürülebilir. Bu çalışmada, 4T1/Her2 hücre kökenli eksozomlar iki güçlü immün adjuvan CpG ODN ve p(I:C) ile yüklendikten sonra bu eksozomların bağışıklık oluşturma kapasitelerini değerlendirdik. Her iki ligand ile yüklenmiş TEX'ler antijene özgü birincil ve bellek T hücresi yanıtlarını aktive etti ve güçlendirilmiş immün sistemi uyarıcı özellikler gösterdi. Ayrıca, eksozom bazlı aşı adayımız, yüksek IgG2a ve IFNγ salgılayarak güçlü Th1-destekli bağışıklık ortaya çıkardı. CpG ODN ve p(I:C) yüklü 4T1 tümör kökenli eksozomların meme kanseri modelinde terapötik olarak farelere uygulanmasının, 4T1 tümör taşıyan farelerde tümör büyümesini gerilediğini bulduk. Sonuç olarak, bu çalışma, eksozom bazlı bir terapötik aşının, yerleşik tümörleri tersine çevirmek için yeterli olan güçlü hücresel ve hümoral anti-tümör bağışıklığını desteklediğini ortaya koydu. Bu tezin son bölümünde, süper paramanyetik demir oksit nanopartiküller (SPION) ve immün sistemi uyarıcı ligandlarla yüklü hücre hattından üretilmiş eksozomların terapötik potansiyelini inceledik. Öncelikle, SPION yüklemesinin eksozomların bağışıklık hücreleri tarafından alınımını arttırdığını gösterdik. Ayrıca, SPION ve CpG ODN yüklü eksozomlarla inkübe edilen dalak hücrelerinin, önemli ölçüde yüksek IL-12 ve IFNy indüklediğini bulduk. Son olarak, atimik farelerde oluşturulan insan hepatoselüler karsinom tümör modelinde eksozomal aşı adayımızı test ettik. SPION, TLR3 ve TLR9 ligandları ile yüklenmiş eksozomlar doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu indükledi. Ayrıca, hepatoselüler karsinom tümör oluşturan atimik farelerde tümörlerin gerilediği ve tedavi edilen farelerin hayatta kalma oranını artırdığını gösterdik.