Investigation of neuroendocrine effects of methylphenidate on gonadotropin releasing hormone and kisspeptin in cell culture models

Metilfenidat (MPH), dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu için çocuklarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Kullanımının büyüme ile ilgili etkileri hakkında tartışmalar olmasına rağmen, MPH'nin ergenliğe geçiş sırasındaki nöroendokrin mekanizmaları henüz detaylı araştırılmamıştır. Bu çalışma, MPH'nin gonadotropin salgılatıcı hormon (GnRH) ve Kisspeptin (Kiss1) ekspresyonu ve salgılanması üzerindeki rolünü hücre kültürü teknikleri kullanarak in vitro olarak araştırmayı amaçlamaktadır. GnRH ve Kiss1 salgılayan hücreler, sırasıyla GT1-7 ve rHypoE-8, %5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer altında 37°C'de %10 FBS ve %1 PSN içeren DMEM içinde tutuldu. MPH'nin 24 saat boyunca farklı dozlarda (1 nM-200 μM) proliferasyon ve migrasyon üzerindeki etkisi, sırasıyla tripan mavisi boya yöntemi ve yara iyileşme modelleriyle değerlendirildi. GnRH ekspresyonunu ve salgılanmasını araştırmak için hücreler, MPH'li veya MPH'siz (200 μM) FBS'siz ortamda hücre kültürü yapıldı ve gerçek zamanlı qRT-PCR ile GnRH ekspresyonunu ve ELISA ile ortama GnRH salınımını araştırmak için numuneler toplandı. Verilerin normal dağılımı Shapiro – Wilk normallik testi ile analiz edildi. Doz – yanıt deneylerinden elde edilen veriler, sırasıyla tek yönlü ANOVA ve Kruskal-Wallis, ardından sırasıyla Dunnet'in çoklu karşılaştırması ve Dunn'ın çoklu karşılaştırma testleri ile analiz edildi. Gerçek zamanlı qPCR ve ELISA verileri Student t-testi ve 2-ΔΔCT yöntemi ile analiz edildi. MPH'ye maruz bırakılmış ve bırakılmamış hücreler arasında proliferasyon ve migrasyon açısından anlamlı bir fark yoktu. Hücrelerin proliferasyon ve migrasyonu, farklı MPH konsantrasyonlarından etkilenmediğinden, gen ekspresyonunu ve hormon salınımını değerlendirmek için en yüksek 200 μM konsantrasyon seçildi. GnRH ekspresyonu, herhangi bir zaman noktasında istatistiksel bir fark olmaksızın kontrol koluyla istatistiksel olarak benzer aralıkta seyretti. GnRH salınımı, tedaviden 2 saat sonra kontrol grubuna kıyasla MPH altında önemli ölçüde daha yüksek bulundu (p<0.05), diğer zaman noktalarında gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmadı. Kiss1 ekspresyonu, 30 dakikalık, 2 saatlik ve 24 saatlik zaman noktaları için değerlendirildi. Kiss1 ekspresyonu, MPH tedavisinin ilk 30 dakikasında istatistiksel olarak anlamlı ölçüde arttığı gözlemlendi. MPH, GnRH ve Kiss1 ekspresyonunu çoklu zaman noktalarında etkilediğinden, hücrelerin tepkisini daha fazla araştırmak için MPH tedavisinin kesilmesinden sonra ekspresyondaki değişim analiz edildi. MPH tedavisinin kesilmesinden sonra, GnRH ekspresyonunda kontrol ve deney kolları arasında istatistiksel bir anlamlılığın olmadığı gözlendi. Hücresel kanıtlar, MPH'nin GnRH ve Kiss1'in ekspresyonunu ve salınımını bir dereceye kadar etkilediğini öne sürse de, hücre kültürünün klinik gerçeği yansıtma gücü sınırlıdır. İstatistiksel farkın olmaması, MPH kullanımının hücresel davranış üzerinde fark yaratacak etkisi olmadığı şeklinde yorumlanmamalıdır. Sonuçlar daha büyük veri kümeleri (n= 30 – 60) için istatistiksel olarak modellendiğinde, çoğu zaman noktası kontrol koluna kıyasla anlamlı hale geldiği gözlemlendi. Sonuçlarımız, MPH'nin ergenliği geciktirici etkilerinin kısmen GnRH ve Kiss1 ekspresyonu ve salınımı yoluyla olabileceğini düşündürmektedir. Dünya çapında 40 milyon insan üzerinde doğrudan etkisi olabilecek bir ilacı anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç var. Bulgularımız, MPH'nin ergenliği geciktirici etkilerinin kısmen GnRH ve Kiss1 ekspresyonu ve salınımı yoluyla olabileceğini düşündürmektedir. Dünya çapında 40 milyon insan üzerinde doğrudan etkisi olabilecek bir ilacı anlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.