Development of a novel approach for cell surface protein analysis

Plazma membran tüm hücrelerde evrimsel süreçte korunmuş bir hücresel yapıdır. Hücresel madde alış verişi, sinyal iletimi, hücreler arası iletişim, hücre göçü ve hücre bölünmesi gibi birçok hayati metabolik yolakta direk veya dolaylı olarak görev alır. Bu yüzden bu gibi mekanizmaların anlaşılması, bu yolakların kontrollerinin aydınlatılması için plazma membranını oluşturan bileşenlerin görevlerini ve bunların hücrenin iç bölgeleriyle nasıl etkileşimde olduklarını bilmemiz gerekmektedir. Proteomik metotları kullanmak bu gibi soruları cevaplamak için kullanılabilecek tarafsız yollardan biridir. Fakat plazma membran proteinlerinin kendilerine özgü yapıları ve az miktarda bulunmaları normal proteomik metotların plazma membranı üzerinde kullanımını engeller. Bu yüzden daha etkili plazma membran protein analiz yöntemlerine ihtiyaç duymaktayız. Tezimin ilk bölümünde, plazma membranı proteinlerini zenginleştirmek için yeni bir metot geliştirdim. Bu metotta santrifüj ve BioID protein zenginleştirme metotlarını birlikte kullandım. Bunun için bir Biotin ligaz enzimi olan BirA enzimini hücre zarını hedefleyecek ve biotinleyecek şekilde modifiye ettim. Sonrasında peş peşe fiziksel ve affinite temelli protein zenginleştirme metotlarını kullanarak plazma zarı proteinlerinin eldesini hedefledim. Sonrasında proteinleri hücre spektrometrisini kullanarak proteinleri analiz ettim. Tezimin ikinci bölümünde, Chloride Intracelluar Channel (CLIC) protein ailesinin iki üyesi olan CLIC1 ve CLIC4 proteinlerinin karakterizasyonu üzerine çalıştım. Yakın zamanlarda laboratuvarımızdan yayınlanan çalışmada CLIC1 ve CLIC4 proteinlerinin mitoz sırasında hücre zarında zenginleştiğini gösterdik. Literatürde henüz CLIC proteinlerinin hücre döngüsüyle ilgili bir fonksiyonu rapor edilmedi. Bu sebeple, CRISPR-Cas9 metodunu kullanarak CLIC1 ve CLIC4 nakavt memeli hücre hattı ürettik ve bu hücrelerde sitokinez analizi yaptım. CLIC1 ve CLIC4 nakavt hücrelerde sitokinez hatalarının daha fazla olduğunu ve bu sebeple daha yüksek oranda çok çekirdekli hücre oluşturduklarını bulduk.