Immunotherapeutic action of extracellular vesicles and effects of TLR signaling to immune dysfunction of SCI patients

Bu tezin temel amacı, dıştan yüklenmiş eksozomların hastalıklara karşı koruyucu ve terapötik taşıyıcılar olarak kullanımının in vivo uygulanabilirliğinin genişletilmesidir. Eksozomlar bütün hücreler tarafından salınmakta ve bütün vücut sıvılarından saflaştırılabilmektedir. Fakat saflaştırma sonrası eksozomların istenilen ligandlar ile yüklenmesi pek denenmiş bir yöntem değildir. Bu çalışmada, eksozomların kendi biyolojik kargolarının yanında CpG ODN dizinleri, model protein antijeni ovalbumin ve yağsı ligandlardan alpha-galactosylceramide (αGC) molekülü ayrı ayrı ya da birlikte kullanarak önce liyofilizasyonu yapılıp sonrasında da kontrollü rekonstrüksiyonu sonucunda bu kargoların eksozomlara başarılı bir şekilde yüklendiği gösterilmiştir. Eksozoma yüklenmiş ligandların immünolojik etkinliğinin yüklenmemiş serbest ligandların etkinliğinden daha yüksek düzeyde olduğu belirlenmiştir. In vivo çalışmalarda eksozoma yüklenmiş ligandların E.G7 timoma ve B16 melanoma tümör modellerinde oldukça etkili olduğu saptanmıştır. Gözlenen immün etkinlik artışının arkasındaki mekanizma, eksozomların hedef hücrelere kargoyu bozulmadan taşıyabilmesi ve antijene bağlı immün tepkinin gelişmesini sağlamasına bağlıdır. In vitro çalışmalar, CpG ODN'lerin eksozomlara yüklenmesiyle, serbest CpG ODN'lere göre immün uyarıcı etkinliğini artırdığını IL6, IL12, tip I ve II interferonlar gibi sitokinlerin yüksek seviyelerde salınmasını sağladığını gösterilmiştir. Bu artan immün etkinlik kısmen CD86/MHCII yüzey markörlerinin artışıyla gösterilen antijen sunum hücrelerin aktivitesindeki artıştan kaynaklanıyor olabilir. C57/B16 farelerin eksozomal CpG ODN ve OVA ile aşılanması güçlü bir anti-OVA Th1 tepkisine yol açmıştır. Aşılanmamış ve aşılanmış hayvanlarda timoma tetiklendiğinde, eksozomal aşı ile aşılanmış farelerin 85%'inde tümör gerilemişken, neredeyse bütün aşılanmamış hayvanlarda tümör gelişimi görülmüştür. Bu bulgular, CpG ODN'lerin eksozomlara yüklenmesiyle oluşan immün uyarıcı mekanizmanın, güçlü anti-OVA bağışıklığı sağladığını ve farelerde anti-tümör tepkisini geliştirdiğini göstermektedir. Bu tezin ikinci bir amacı, eksozomların ikiden fazla ligand ile yüklenmesinin uygulanabilir olduğunu göstermektir. İnvaryant doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerinin ligandı αGC, eksozomlara OVA ve CpG ODN'lerin yanında üçüncü ligand olarak katılmıştır. Ön in vivo çalışmalar, αGC içeren eksozomların antijene bağlı immün tepkiye yol açmada ligandların serbest formlarina kıyasla çok daha etkili olduğunu ortaya çıkarmıştır. Terapötik tümör aşılaması modelinde, B16-OVA tümörü taşıyan hayvanlara 9. ve 15. günlerde iki eksozom enjeksiyonu yapılmış ve tümörlerde gerileme gözlenmiştir. Üç ligandla yüklenmiş eksozomlarla tedavi edilen farelerde eksozoma yüklenmemiş ligandlarla tedavi edilen farelere göre tümörlerde daha ciddi bir azalma görülmüştür. Bu çalışma, üçlü ligandlarla yüklenmiş eksozomların tümör gelişimini etkili bir şekilde geriletebildiğini ortaya koymuştur. Bu tezde ayrıca, hücre dışı keseciklerin (EV) otoimmün ve otoinflamatuar hastalıkların patogenezindeki rolü araştırılmıştır. Behçet Hastalığı'nın (BH) patogenezinin altında yatan mekanizma hala belirsizdir. Çalışmalarımız, BH hastalarının plazmalarında EV'lerin yanısıra bir cathelicidin grubu üyesi antimikrobiyal peptid olan LL37'nin yüksek miktarda bulunduğunu göstermiştir. Çarpıcı bir şekilde, plazmadaki LL37'nin büyük çoğunluğunun dolaşımdaki EV'lerle asosiye olduğu tespit edilmiştir. Bu bağlantı hem EVlerin monositlere ve plazmasitoid dendritik hücrelere sevkiyatının artmasına, hem de IL1β, IL6, IP10, IFNα gibi sitokinlerin üretiminin işaret ettiği üzere immün aktivasyonunun tetiklenmesi ve sürdürülmesine aracılık etmekte, böylece şiddetli ve uzun süreli BH patolojisine katkıda bulunmaktadır. Çalışmalarımızda LL37 seviyesi, plazmadaki EV miktarı ve sitokin üretimi arasında güçlü bir korelasyon olduğu bulunmuştur. Bu tezin son kısmında, kronik omurilik hasarlı hastalarda şiddetli nörolojik bozulmaya katkı sağlayan immün bozukluğun muhtemel bir mekanizması açığa çıkarılmıştır. Kronik omurilik hasarlı hastalarda enfeksiyona yatkınlık ile patojen ilişkili moleküler desenlerin (PAMP) tanınmasındaki bozukluklar arasında bir korelasyon olup olmadığı araştırılmıştır. Omurilik hasarlı hastalarda, B hücreleri ve CD4+ Treg hücrelerinin etkinliğinde bir bozukluk olmamasına rağmen, monositler ve plazmasitoid dendritik hücreler tarafından TLR7 ve TLR9 ligandlarının tanınmasının işlevsiz olduğu, bunun da düşük IFNγ ve IP10 üretimi ile yardımcı uyaran molekül ifadesinde azalmaya yol açtığı belirlenmiştir. Bu mekanizma, omurilik hasarlı hastalardaki immünolojik bozukluğa bağlı kalıcı komplikasyonlara olan katkısını açıklayabilir.