Cell-free synthetic biology enabled RHA toehold switch system for influenza viruses

Influenza A H1N1, hızlı bulaşma kabiliyeti ve mevsimsel salgınlar ile pandemilere yol açabilme potansiyeli nedeniyle küresel düzeyde önemli bir halk sağlığı tehdidi olmaya devam etmektedir. Bu virüsle etkin şekilde mücadele edebilmek için, hızlı, doğru ve düşük maliyetli tanı yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada, Influenza A H1N1 virüsüne özgü RNA dizilerini seçici olarak tanıyabilen programlanabilir RNA tabanlı düzenleyici elemanlar olan toehold switch'lere dayalı sentetik biyoloji temelli bir tanı stratejisi sunulmuştur. Bu sistem, hedef viral RNA bulunmadığında translasyonel olarak baskılanan, ancak özgül diziyi tanıdığında protein ekspresyonunu aktive eden tasarımlara dayanmaktadır. İlk switch tasarımları, yapısal kararlılık ve fonksiyonel bölgelerin erişilebilirliğini değerlendirmek amacıyla NUPACK ve RNAfold gibi termodinamik modelleme araçları kullanılarak oluşturulmuş ve analiz edilmiştir. Özellikle ribozom bağlanma bölgesi (RBS) ve başlangıç kodonunun çevresindeki yapısal engellerin düşük performansla ilişkili olduğu belirlenmiş ve entropi profilleri ile serbest enerji dağılımları temel alınarak rasyonel dizayn iyileştirmeleri yapılmıştır. Optimize edilen switch dizileri T7 promotörü altında ekspresyon sağlayan plazmitlere klonlanarak, in vitro transkripsiyon-translasyon reaksiyonları ile test edilmiştir. Elde edilen GFP tabanlı floresan ölçümleri, hedef RNA'nın varlığı ve yokluğu koşullarındaki gen ekspresyon düzeylerinin nicel karşılaştırılmasına olanak sağlamıştır. Elde edilen deneysel veriler, optimize edilmiş switch tasarımlarının daha yüksek sinyal-gürültü oranları, daha düşük bazal ekspresyon ve tekrarlanabilir katlanma değerleri sağladığını ortaya koymuştur. Genel olarak bu çalışma, rasyonel olarak tasarlanmış RNA tabanlı switch'lerin Influenza A H1N1 için modüler, programlanabilir ve düşük maliyetli bir tanı platformu olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca burada ortaya konan tasarım yaklaşımı, diğer viral patojenlerin tanısı için benzer RNA algılayıcı sistemlerin geliştirilmesinde de genel geçer bir çerçeve sunmaktadır.