İnsan bax geni promotör bölgesinin fonksiyonel analizi

Kanserlerin çoğu insan hayatındaki bir takım genetik değişimler sonucu oluşur. Onkogenler ve tümör baskılayıcı genler büyümeyi kontrol eden genlerdir. Onkogenler, normalde büyümeyi uyaran proteinleri kodlar. Aşırı sentezleri, translokasyonları ve mutasyonları sonucu malign transformasyon oluşur. Tümör baskılayıcı genler ise normalde büyümeyi inhibe eden proteinleri kodlar. Bu genlerde delesyonların meydana gelmesi, transkripsiyon olayının gerçekleşmemesi ve protein inaktivasyonu ile fonksiyon kaybına uğramaları halinde istenmeyen durumlar oluşabilmektedir. Bu çalışmada apoptoz mekanizmasında önemli bir potansiyele sahip olan proapoptotik Bax geninin karakterizasyonu ve promotör bölgesinin fonksiyonel analizi yapıldı. Bu amaçla öncelikle biyoinformatik programlarından ve çeşitli veritabanlarından yararlanılarak Bax geninin 5000 bp'lik promotör bölgesi belirlendi. Fakat çalışmamızın genelinde yapılan analiz çalışmaları işlevsel olduğunu düşündüğümüz 2000 bp 'lik promotör parçası üzerinde gerçekleştirildi. Bu bağlamda öncelikle genin transkripsiyon başlama bölgesi, TATA bağlanma kutusu ve muhtemel p53 bağlanma bölgeleri tespit edildi. Daha sonra çeşitli literatür taramaları ve software programlarıyla bu bölge üzerindeki muhtemel transkripsiyon bağlanma bölgeleri ve motifleri belirlendi. Yapılan analiz çalışmaları sonucunda bu 2000 bp'lik parça işlevsel özelliklerine göre dört alt parçaya ayrıldı. Ve her bir parça pGEM-T Easy vektörüne klonlandı. Bu bağlamda öncelikle insan genomik DNA'sı satın alındı. Seçilen bölgelere spesifik dizayn edilen primerlerle PCR yapılarak her bölge saf olarak elde edildi. Her bölgeye ait saf bantlar jelden ekstrakte edilerek pGEM-T Easy vektörüne klonlanarak Escherichia coli JM109 bakterisine transforme edildi. Klonlanan her bir parçadan plazmit izolasyonu yapıldı.