Molecular studies on the cloning and expression of human beta interferon gene in E. coli

Viral ve viral olmayan enfeksiyonlara yanıt olarak memelilerde birçok hücre tipi tarafından üretilen İnsan interferon beta (hIFNβ), bir immünoregülatör görevi görür ve multipl skleroz, astım, hepatit B ve C, insan papilloma virüsü gibi çeşitli hastalıklar ve çeşitli kanserler için önemli bir terapötik ilaç olma potansiyeline sahiptir. Moleküler boyutu nedeniyle recombinant IFNβ1b (rIFNβ1b) üretiminin klinik uygulamaları ve elverişliliği göz önüne alındığında, bu terapötik proteinin saf ve yüksek verimini sağlayabilecek düşük maliyetli bir üretim sistemi oluşturmak çok önemlidir. Prokaryotik sekresyon sistemleri, protein üretiminde proteinleri periplazmaya veya hücre zarının dışına ekspres olması için çoğunlukla tercih edilir. Böylece, ekspresyon sistemi, sonraki işlemleri basitleştirir ve protein yıkımını ve maliyetini azaltır. IFNβ1b ekspresyonu için oldukça arzu edilen ve özelleştirilebilir bir sistemdir. Türkiye'de yüksek fiyatlarla ithal edilen lisanslı yerli rekombinant protein üretimi henüz gerçekleştirilememiştir. E. coli hücrelerinin periplazmasına insan rIFNβ1b proteinini ekspres eden yeni vektörlerin yapımını tarif eden bazı raporlar vardır. Bu çalışmada, insan rIFNβ1b proteinini periplazmik bölgede ekspresyonu için, E. coli kodon tablosuna göre optimize edilmiş rIFNβ1b geni, biyoinformatik araçlarla elde edildi. Elde edilen gen, pelB sinyal peptidini içeren pET22b ekspresyon vektörüne klonlandı. Daha rIFNβb peptit sentezi, 25°C'de 0.4 mM IPTG ile indüklenen E. coli/BLR(DE)3 suşunda gerçekleştirildi ve daha sonra konağın ortamından, periplazmik ve sitoplazmik bölgesinden izole edilip Ni-NTA affinite kolon ile pufiye edildi. Recombinant IFNβ1b, (~ 18 kDa), üretimi %12 SDS-PAGE ve Western Blot analizi ile belirlenmiştir. Sonuçlarımız, optimize edilmiş IFNβ1b proteininin hücre içi çözünür ekspresyonunun gerçekleşmediğini gösterdi. Bu durum deneysel olarak doğrulanamamasına rağmen, uygun olmayan kodon optimizasyonu nedeniyle rIFNβ1b mRNA'ların katlanmış formunun üretildiğini ve bu yapının rIFNβ1b mRNA'ların çevrilmesini engellediğini düşünülmektedir. Prokaryotik sekresyon sisteminin yeniden yapılandırılması ve kodon optimizasyonları, rIFNβ1b proteininin daha uygun üretimini ve saflaştırılmasını geliştirebilir.