Immunomodulatory potential of human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cell (UCX®) exosomes in combination with immunosuppressive "A151" oligodeoxynucleotide

Mezenkimal stromal hücreler veya mezenkimal kök hücreler (MKHler) doku yenileyici özelliklerinin yanında immün yanıtı düzenleyici özelliklere de sahiptir. Araştırmalar MKHlerin etkilerinin çoğunun parakrin bir şekilde ve eksozom adı verilen hücre dışı kesecikler ile sağlandığını göstermektedir. Bu çalışmada, patentli ve özel bir MKH türü olan, göbek kordonu dokusundan elde edilen ve UCX® adı verilen MKHler kullanılmıştır. UCX® hücreleri immün baskılayıcılık açısından altın standart olan kemik iliği MKHlerinden üstündür. Çalışmanın amacı UCX® eksozomlarını karakterize etmek ve immün düzenleyici terapi yöntemi olarak test etmektir. Bir başka amaç da 2 boyutlu (2D) hücre kültürü ile 3 boyutlu (3D) hücre kültüründen elde edilen eksozomların fonksiyonel olarak karşılaştırılmasıdır. 3D kültür hücreler arasında ve hücreler ile hücre dışı matris arasında daha fazla etkileşim sağladığı için canlı organizmadaki duruma daha yakındır. A151 ODN adı verilen ve memeli telomerlerindeki TTAGGG motifinin 4 tekrarından oluşan sentetik oligodeoksinükleotid geniş kapsamlı immün baskılayıcı etkilere sahiptir. A151 ODN'in lipozom veya eksozomlara yüklenmesi nükleazlar tarafından parçalanmasını önleyerek etkinliğini artırmaktadır. Bu çalışmada, A151 ODN'i UCX® eksozomlarına yükleyerek iki ajanın immün düzenleyici etkilerini birleştirmek ve sinerjik etki elde etmek amaçlanmıştır. Grubumuzca geliştirilen yükleme tekniğiyle A151 ODN eksozomlara yaklaşık %95 verimle yüklenebilmiştir. Öncelikle, farklı immün hücrelerin UCX® eksozomlarına bağlanma ve eksozomları içine alma kapasiteleri incelenmiş ve 3D eksozomların hedef hücrelerle daha çabuk ve daha fazla etkileşime girdiği görülmüştür. Eksozomların Toll-benzeri reseptör (TLR) yolaklarına etkisi fare dalak hücrelerinde ve kemik iliğinden farklılaştırılmış makrofajlarda (BMDMler) incelendiğinde, eksozomların TLR1/2, TLR4, TLR7/8 ve TLR9 yolaklarının aktivasyonu sonucu gerçekleşen IFNγ, IL6, IL12, ve daha az ölçüde TNFα üretimini bastırabildiği ve 3D eksozomların genel olarak 2D eksozomlardan daha etkin olduğu görülmüştür. Eksozomlara A151 ODN yüklenmesi enflamatuar sitokinlerin baskılanmasını artırmıştır. Ayrıca eksozomlar, özellikle 3D eksozomlar, BMDMlerde TLR yolaklarının aktive edilmesi üzerine artan yardımcı uyarıcı CD80 ve CD86 molekülleri ile antijen sunucu MHC-II molekülünün miktarlarını azaltmıştır. Makrofaj polarizasyonu deneyleri ise eksozomların BMDMleri yüksek miktarda nitrik oksit ve arjinaz üretecek şekilde programladığını göstermiştir. Bu iki faktör, myeloid kökenli baskılayıcı hücrelerin (MDSCler) T ve NK hücrelerini baskılamakta kullandıkları ana faktörlerdir. Makrofajları MDSC benzeri baskılayıcı bir fenotipe çekmelerinin yanı sıra, eksozomlar farelerde karın içi enjeksiyon yoluyla uygulandıklarında MDSC popülasyonlarını artırmışlardır. UCX® eksozomlarının A151 ODN varlığında ve yokluğunda immün düzenleyici etkileri farelerde zymosan ile uyarılmış peritonit modeli ve dekstran sodyum sülfat ile uyarılmış kolit modelinde test edilmiştir. Akut ve şiddetli bir enflamasyon olan peritonit modelinde eksozomlar enflamasyonu baskılayamasa da, kolit modelinde özellikle tek başına 3D-eksozomlar ve iki eksozom tipinin de A151 ODN yüklü halleri hastalığın ilerlemesini durdurabilmişlerdir. Boş veya A151 ODN yüklü 3D-eksozomlar kilo kaybını ve kolon boyutlarındaki kısalmayı engellemiş, lenf nodları ve dalaktaki DSS kaynaklı T-hücre kaybını ve T-hücrelerinden sitokin salımındaki disregülasyonu onarabilmiştir. A151 ODN yüklenmiş veya yüklenmemiş bütün eksozomlar ise lenf nodlarına DSS kaynaklı makrofaj birikmesini önlemiştir. 3D eksozomlar ve iki eksozom tipinin de A151 ODN yüklü halleri serumda DSS ile artan IL6 miktarını normalize edebilmiş ama sadece A151 ODN yüklü 3D-eksozomlar makrofajların tekrar uyarım sonucu sitokin üretim kapasitesinde etkili olmuştur. Son olarak, eksozomların A151 ODN varlığında ve yokluğunda yara iyileşmesine etkileri araştırılmıştır. 2D ve 3D eksozomlar fibroblast ve keratinosit hücre hatlarında yara iyileşmesi ile alakalı IL1α, TGFβ ve VEGFα gibi faktörlerin üretimini farklı derecelerde artırmıştır. Farede yara iyileşmesi modelinde A151 ODN varlığında ya da yokluğunda eksozomlar yara iyileşmesini hızlandırmamış olsa da iyileşmenin son safhalarında sistemik bir immün baskılanmaya sebep olmuşlardır. Bu sistemik etkilerin içerisinde makrofajların enflamatuar kapasitlerinde azalış ve granülositik MDSC popülasyonunda artış vardır. A151 ODN yüklü 3D eksozomlar ayrıca T hücre sayılarını ve dolaşımdaki enflamatuar sitokin miktarlarını da düşürmüştür. Topluca ele alındığında bu çalışma 2D ve 3D hücre kültürlerinden elde edilen eksozomların fonksiyonel açıdan farklı olduğunu, 3D kültürden izole edilen eksozomların daha immün baskılayıcı olduğunu, A151 ODN yüklenmesinin eksozomların immün baskılayıcı kapasitlerini artırdığını ve A151 ODN yüklü UCX® eksozomlarının enflamatuar ve otoimmün hastalıklarda değerli bir tedavi yaklaşımı olabileceğini göstermektedir.