İnsan karbonik anhidraz ıı enziminin (hCA II) klonlanması, E. coli'de ekspresyonu, karakterizasyonu, yönlendirilmiş mutagenez ile mutant hCA II genlerinin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

İnsan karbonik anhidraz II (hCA II) enzimi ilk kez pET SUMO ekspresyon vektörü kullanılarak E. coli'de eksprese edildi ve rekombinant enzim, nikel (Ni+2) afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. hCA II'nin hidrofobik kısmındaki Trp 209 aminoasiti, bölge yönelimli mutagenez yöntemi ile dört farklı amino asit (Val, Leu, Ile ve Pro) ile yer değiştirdi. hCA II varyantlarının p-nitrofenilasetat esteraz aktivitesi, hidrofobiklik ve rezüdü hacmi ile ilişkilidir, bu bilgi Trp 209 rezidüsünün hidrofobikliğinin katalizleme için önem taşıdığını düşündürmektedir. Bu rezidü önemli bir rezidü olarak tahmin edildi ve bu rezidünün hesaplamalı mutagenezi gerçekleştirildi. Bu öngörü, hCAII mutantlarını (W209V, W209L, W209I, W209P) deneysel olarak üreterek ve bazı benzenesülfonamidlere karşı ilgilerini belirleyerek teyit edildi. Dört mutant enzim doğal tip enzimle kıyaslandığında, benzensülfonamidlere karşı daha az ilgi gösterdi. W209V mutantı, doğal tip enzim ile benzer spesifik aktivite değerlerine sahipken; W209P, W209L ve W209I mutantları doğal tip enzime kıyasla p-nitrofenil esteraz aktivitesinde sırasıyla %60, %30 ve %20 oranında daha az aktif olduğu belirlendi. Enzimin aktif bölgesinin hidrofobik kısmındaki bu mutasyonlar, çözünmeyen protein agregatlarının oluşumuna neden olduğundan, E. coli'de hCA II'nin protein ekspresyonunu azalttı. Bu çalışmadaki bulgularımız hCA II'deki Trp 209'un katlanma sürecinde önemli rol oynadığını ve valin rezidüsünün bu izoenzimin aktif boşluğundaki hidrofobik bölge ile çok uyumlu olduğunu gösterdi. Bu mutant proteinler, gelecekte enzimin yapısal fonksiyonlarının ve ilaç temelli çalışmalarının anlaşılmasına yol açacaktır.