Cloning of bile salt hydrolase gene (BSH) ) from human originated Lactobacillus plantarum and characterization of BSH enzyme by site directed mutagenesis

Gastrointestinal mikrobiyota insan fizyolojisinde önemli bir rol oynar ve konağın beslenme, fizyolojik ve immünolojik fonksiyonlarından sorumludur. Gastrointestinal sistemin mikrobiyal kolonizasyonu, kolorektal kanser etiyolojisinin genetik faktörlerini önemli ölçüde etkiler. Litokolik asit ve deoksikolik asit gibi toksik sekonder safra asitleri, inflamasyon, DNA hasarı ve apoptoz indüksiyonunu etkileyerek kolon kanserine neden olmaktadır. Glisin ya da taurin ile konjuge safra asitlerinin hidrolizi, sekonder safra asitlerinin ortaya çıkması için bir geçiş reaksiyonudur. Çeşitli kaynaklardan elde edilen STH enzimlerinin (EC 3.5.1.24) karakterizasyonu, substrat tercihi ve spesifisiteleri farklılık göstermektedir. STH enzimi ve toksik sekonder metabolitler arasındaki ilişkiyi anlamak için, STH'nin yapısı daha iyi anlaşılmalıdır. Ancak STH enziminin yapısı ve çalışma mekanizması çok iyi bilinmemektedir. Enzimin yapısını ve işlevini anlamak için substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu düşünülen amino asitleri kodlayan bölgeye yönelik yönlendirilmiş mutagenez kullanılır. Bu çalışmada, 324-amino asitten oluşan Lactobacillus plantarum B14 STH geni klonlanmış ve kısmen korunmuş ve substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu düşünülen Phe-18, Tyr-24, Asn-79, Leu-138 ve Asn-180 amino asitleri, yönlendirilmiş mutagenez ile değiştirilerek, enzim aktivitelerine bakılmıştır. Tüm STH 'ler E. coli BLDRE3-pET22b ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutant enzimlerin ve her biri aynı molekül ağırlığı (37 kDa) ve stabilitesi SDS-PAGE ile doğrulanmıştır. Lb. plantarum B14'ün, STH aktivitesi, nicel olarak Direkt Plate Testi ve nitel olarak Ninhidrin Testi ile belirlenmiştir. Mutasyonların substrat özgüllüğü üzerindeki etkileri, altı farklı safra tuzları ile mutant STH enzimlerinin kısmen saflaştırılmasıyla araştırılmıştır. Araştırmada, Lb. plantarum B14 STH'ın tauro-konjuge safra tuzlarına kıyasla glisin ile konjuge safra tuzlarına daha fazla hidroliz sergilediği ve mutant enzimlerin STH aktivitelerinin, farklı safra tuzlarına farklı ölçüde azalan değişimler gösterdiği tespit edilmiştir.