İnsan plasenta ve endotel hücre hatları ile 3b kriyojel ortak kültür sisteminin oluşturulması ve etkinliğinin araştırılması

Gebelik ile birlikte oluşan plasenta bariyeri, yapısı ve transfer kapasitesi ile besin maddelerinin maternal-fetal geçişini, geçiş gradiyentini, feto-plasental ve utero-plasental kan akışını belirlemektedir. Gebelik boyunca kimyasal madde ve ilaç kullanımına maruz kalma oranlarında büyük bir artış meydana gelmiştir. İnsanlar üzerinde etik kısıtlamalar sebebi ile testler yapılamamaktadır. Plasenta bariyerinin geçirgenliği hakkındaki eksikliği tamamlamak için güncel plasenta bariyer modelleri oluşturularak yapılacak olan çalışmalara ihtiyaç artmıştır. Bu tez çalışmasında, insan plasenta koryokarsinom hücreleri (BeWo) ve insan göbek kordonu ven hücreleri (HUVEC) ile birlikte üç boyutlu (3B) ortamda farklı özellikler ile hazırlanmış kriyojel üzerinde mono ve ortak kültür sistemleri oluşturulmuştur. Kriyojeller, hücrelerin tutunmasını ve çoğalmasını sağlayabilecek birbirleriyle bağlantılı makro gözeneklerden oluşmaktadırlar. Tez çalışmasında, 3B por yapısına sahip biyouyumlu poli (2-hidroksietil metakrilat) (PHEMA) kriyojeller, hücre dışı maddeler (HDM) açısından desteklenerek in vivo'ya daha yakın bir sistem oluşturulmuştur. PHEMA temelli kriyojel kullanılarak jelatin içeren kriyojeller (PHEMAGEL) sentezlenmiştir. Tüm PHEMA ve PHEMAGEL kriyojellere folik asit (FA) bağlanmıştır, ayrıca fibronektin (FN) veya kolajen tip IV (KOL Tip IV) yapıya katılarak plasenta dokusuna yakın bir ortam oluşturulmuştur. Farklı içerikler ile sentezlenmiş olan 4 kriyojel grubunun PHEMA, PHEMA+KOL Tip IV, PHEMAGEL ve PHEMAGEL+FN'in karakterizasyon çalışmaları kapsamında şişme testleri yapılarak jellerin şişme özellikleri değerlendirilmiştir. Jelatin, FA, FN ve KOL Tip IV'ün kriyojellerin yapısına katılıp katılmadığı fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektrometresi ile incelenmiştir. Mikro bilgisayarlı tomografi (Mikro-CT) ile kriyojellerin 3B karakterizasyon analizleri yapılmıştır. Kriyojellerin gözenek boyutlarını ve hücrelerin tutunma potansiyelleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir. FA bağlanan kriyojellere in vitro salım analizleri yapılmıştır. Sentezlenen kriyojel gruplarının sito-uyumluluğunu ve hücrelerin proliferasyon yeteneklerini inceleyebilmek için 2, 4 ve 7 gün boyunca hücreler ile birlikte inkübe edilmiştir ve hücrelerin canlılıkları değerlendirilmiştir. Gebelikteki kullanımı ile ilgili literatürde yeterli bilgiye rastlanmamış bir antidepresan etken maddesi olan Vortioksetin, oluşturulan 3B kriyojel ortak-kültür sisteminde değerlendirilmiştir. 30 μM ve 60 μM'lık konsantrasyonlarda 2, 4 ve 7 gün boyunca hücrelerle inkübe edilmiştir. 3-(4,5-dimetiltiyazol2-yl)-2,5-difeniltetrazolyum-bromür (MTT) canlılık analizi ile etkinliği incelenmiştir. İnsan koryonik gonadotropin (β-hCG) hormon üretim miktarı ve matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2) ile matriks metalloproteinaz-9 (MMP-9) protein seviyeleri ölçülmüştür. Kriyojellerin şişme özellikleri incelendiğinde PHEMA temelli kriyojellerde makrogözenek derecesinin daha yüksek olduğu görülmüştür. Jelatine bağlı olarak makrogözeneklilik derecesi, şişme derecesi ve şişme oranlarında düşüş gözlenmiştir. FTIR analizi sonucuna göre jelatinin, FA'nın, FN'nin ve KOL Tip IV'ün kriyojellerin yapısına başarılı bir şekilde katıldıkları görülmüştür. Mikro-CT sonucu kriyojellerin farklı gözenek boyutlarında dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Bu durum hücrelerin tutunmasında ve çoğalmasında artış sağlamıştır. SEM görüntüleri ile birbiriyle bağlantılı oldukça geniş gözeneklere sahip kriyojellerin sentezlendiği görülmüştür. FA'in in vitro salımında inkübasyon süresine bağlı olarak azalma görülmüştür. Kriyojellerin sito-uyumluluğunu anlayabilmek için yapılan MTT analizi sonucunda hücrelerin çeşitli özellikler ile sentezlenen kriyojellere uyumlu olduğu, hücreler üzerinde toksik bir etki yaratmadığı gözlenmiştir. 3B kriyojel ortak kültür sistemine Vortioksetinin yüksek dozlarında mono kültürlerde hücre canlılığında azalma görülmüştür ancak ortak kültürün aynı dozlarındaki hücre canlılığında beklenen azalma görülmemiştir. BeWo ve ortak kültür grubunda β-hCG hormon miktarı ölçülmüştür ve PHEMA+KOL Tip IV'ün BeWo hücresinde en fazla hormon salımı görülmüştür. MMP-2 ve MMP-9 protein seviyelerinde Vortioksetin doz uygulamasına bağlı olarak anlamlı azalma görülmemiştir. Bu tez çalışmasında, yapısında jelatin, FN ve KOL Tip IV içeren kriyojeller sentezlenerek FA ile bağlanmıştır. Plasental BeWo ve endoteliyal HUVEC hücreleriyle biyouyumlulukları gösterilmiş ve ortak kültür ortamında ilk kez PHEMA kriyojeller üzerinde üretilmiştir. Oluşturulan 3B sistem ile gebelikte kullanılan Vortioksetin antidepresan etken maddesinin toksisitesi değerlendirilmiştir. Sonuçlar kriyojel sisteminin mono ve ortak kültürler için biyouyumlu olduğunu, sitotoksisite açısından ise mono kültürlere kıyasla ikili ortak kültür gruplarında canlılığı düşürmek için dozların daha yüksek olması gerektiğini göstermiştir. Bu 3B kriyojel sistemi yeni ilaç, kozmetik madde, gıda toksisitesi gibi alanlarda in vivoyu yansıtan ve benzer cevaplar veren bir sistem olarak kullanılabileceğini göstermiştir.